实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白

姓名：郭沈杰 年级专业：2012级生物科学 同组者：蔡萍萍

学号：12050011012

实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白

一、实验目的

掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。

血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。

三、实验仪器

1、 牛血清

20131109

2、 醋酸纤维薄膜

3、 镊子

4、 电泳仪

5、 电泳槽

6、 盖玻片

四、实验试剂

1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。

2、 染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。

3、 漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。

五、实验步骤

1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。

2、点样：取盖玻片一块，用玻璃棒将血清均匀的涂在盖玻片的一端面上，直直的在薄

20131109

膜一端1/3处点样。

3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。

4、 染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液（回收）中10分钟，进行染色。

5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。

6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。

注意事项：

1、醋酸纤维薄膜在光下面能明显区分有光泽面和无光泽面；

2、电泳槽中间为正极，两端为负极；

3、染色液用完后回收到原来的试剂瓶中；

4、漂洗薄膜时，做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。

六、实验结果

电泳结果如下

20131109

七、实验分析

1、醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白的原理：

蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH2、电泳注意事项：

电泳时需要注意电流和电压的控制，以及电泳时间。根据图谱分析可以估算血清中蛋白质的相对含量。图谱中颜色的深浅和面积大小可以反应血清蛋白质的含量，颜色较深者含量高，面积较大者含量高。

由于电离时间等因素的影响，实验存在一定的误差。

20131109

3、生物化学醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的试验中，如果区带的分离效果不好，可能存在的影响因素：

1.电泳时间不足

2.薄膜在染色或漂洗时重叠紧密且时间很长

3.薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足

4.点样时薄膜上是否存在多余的水分...

4、用醋酸纤维薄膜法可以将血清蛋白质分为哪几个区带

可分5条带，分别为：α1—球蛋白、α2—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白、白蛋白。

可能分子量越小，带电量越高，运动速度越快。而这五种蛋白的分子量不同，带电量也不同，在电泳时的速度有快有慢。

八、思考题

1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些，其是如何影响的？

血清变质：条带数会有偏差。

巴比妥溶液PH不合适：影响电泳速率。

20131109

漂洗次数过多或时间过长：看不清楚条带。

点样没点好浓度不均或者条带模糊。

2、实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性，应该如何改正？

点样没有点好，盖玻片要直直的压在薄膜上，否则血清不均匀，影响电泳条带形状；

血清不宜过多，若过多则条带过宽，分离不完全；

也不易过少，过少则条带分离不完全。