1、基本概念 1．1
生物技术
广义的生物技术是指人类对生物资源(包括动物、植物、微生物)的利用、改造的相关技术。其发展经历了三个不同的阶段—— 以酿造为代表的传统生物技术；以微生物发酵为代表的近代生物技术；以基因工程、细胞工程、酶工程和蛋白质工程为代表的现代生物技术。
现代生物技术可以理解为是直接操纵有机体细胞和基因的一种全新技术，是二十世纪70年代开始异军突起的高技术领域，在医疗、制药、农业、轻工食品及环保业发展迅速。60％以上的生物技术成果集中应用于医药工业。 1．2 现代生物技术两大核心工程 ． 1)基因工程
概念：基因工程是分子遗传学和工程技术结合的产物。是现代生物技术的核心，它能按人类需要，把遗传物质DNA分子从生物体中分离出来，进行剪切、组合、拼装，合成新的DNA分子。再将新的DNA分子植入某种生物细胞中，使遗传信息在新的宿主细胞或个体中得到表达，以达到定向改造或重建新物种的目的。 2)细胞工程
概念：利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。并使之分裂生长成为杂种生物。它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段的重组等。 ． 1．3 现代生物制药 ．
主要指基因重组的蛋白质分子类药物的制造过程，即利用基因工程、抗体工程或细胞工程技术生产的源自生物体内的天然物质，用于体内诊断、治疗或预防药物的生产过程(也可称基因工程制药)。 2、基因操作技术
基因大分子的分离主要指质粒(plasmid DNA)和基因组DNA的分离。质粒分离的常用方法有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂裂解法、质粒DNA释放法、酸酚法等。质粒在基因工程中最常用来做成各种克隆载体(cloning vector)或表达载体(expression vector)。质粒载体还可用于RNA干扰(RNA inter-ference)的研究[1](由于这一技术的研究和应用,美国科学家Andrew Z. Fire博士和Craig C. Mello博士获得了2006年度的诺贝尔生理学或医学奖)。
基因组DNA的分离通常采用酚-氯仿法、基因文库(gene library)、Southern杂交以及PCR扩增技术等。其中基因文库是指含有某种生物基因组不同基因片段的一群DNA重组体克隆,包括cDNA文库(com-plementaryDNA library, cDNA library)和基因组DNA文库(genomic library)。最近又有研究者利用名为chum-RNA的小分子RNA建立非PCR扩增的单细胞cDNA文库[2]。
2.1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。该法由Mullis等人于1985年发明,并于1993年获得了诺贝尔化学奖。PCR技术可分为定性PCR和定量PCR。
2.2 定性PCR技术包括:反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR),是从非常少量的mRNA样品构建大容量cDNA文库的方法,还发展出实时RT-PCR用于定量实验[3];多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR反应体系中加入多对不同的引物,以扩增同一模板的不同区域;反向PCR( inverse PCR),该法可以对一个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究;锚定PCR(an-chored PCR),现称为cDNA末端快速扩增技术(rap-id amplification of cDNA ends,RACE)[4]。
2.3 定量PCR技术以实时PCR(real time PCR)为代表,其基本原理是在PCR反应体系中引入荧光标记分子,对每一反应时刻的荧光信号积累进行实时监测,计算出PCR产物量,或通过标准曲线法得出初始模板量。
2.4 基因芯片(gene chip ormicroarray),是生物芯片的一种,其基本技术包括:核酸方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测及读出。根据用途不同可分为表达谱芯片(expression profile chip)、测序芯片和诊断芯片。其中表达谱芯片的应用最为广泛,可用于基因功能分析、疾病发生机制的探讨及药物研究和筛选[5]。(1)确定药靶基因:通过比较正常细胞与异常细胞表达谱之间的差异,从而确定药靶基因。(2)监测药物治疗前后的基因表达变化:该监测可有3方面的作用。一是用于研究药物作用机制,通过监测基因表达的变化,可研究药物作用途径和对细胞信号转导的影响,从而了解该药物的作用机制;二是用于研究药物毒理,从表达谱的改变和异常表达,便可分析药物毒理;三是用于药物筛选,利用用药前后表达谱的改变,通过分析病理、生理、生化原理,能高效地筛选出新的药物或先导化合物。
2.5 导入宿主细胞的外源基因,通过基因表达得到相应的蛋白质产物。根据宿主细胞的不同可分为原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。在外源基因表达时,通常把一个报告蛋白的基因与一个目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的检测与纯化。常用的报告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)等。其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科学家因此获得诺贝尔化学奖:日本科学家Osamu Shimomura、美国科学家Martin Chalfie、美籍华人科学家钱永健。除了直接标记目的蛋白用于检测与纯化外,还可利用某些GFP具有荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的现象,用于蛋白质折叠[6]、蛋白质-蛋白质相互作用[7]、信号转导通路等[8]方面的研究。 3、现代生物制药的现状
3.1世界生物制药的现状
到2004年底，全球有4 000余家生物技术公司从事基因工程药物研发，上市200种基因工程药物，研制2 200种，其中，有1 700种进入临床研究。至2005年底，全球生物技术药品销售达540亿美元，在同年年销售收入10亿美元的82个产品中有11种是生物制药产品。 3.2 我国生物制药的现状
至2004年，我国有现代生物制药企业114家，其中疫苗生产企业28家，可以生产27种基因工程药物和26种病毒的41种疫苗。按现价统计规定，生物生化制品生产企业全国409家，总产值220亿元，销售收入196亿元。“十五”前四年，平均每年大于20％的速度增长，用于该领域的投资不断加大，固定资产平均增长32．5％。我国现已成为世界疫苗最大生产国，年产量超过了10亿个计量单位。儿科常见病疫苗年产量达5亿人份，除满足自用外，还向世界卫生组织(WHO)提供疫苗产品，用于其他国家。 3.3 我国生物制药存在的问题及应采取的措施
我国生物制药存在一系列问题：开发水平低，缺少创新产品；生物制药产业下游技术薄弱；重复生产严重、资源浪费过大；产业化规模小、市场竞争无序。可采取的措施：以仿制促进创新，最终以创新实现产业飞跃；多渠道建立融资网络；改革科研体制，建立新的产学研一体化的机制；加强国际交流与合作，积极应对国际竞争；加强宏观调控，强化和规范财税优惠政策。 4、基因工程在生物制药中的发展趋势
目前基因工程药物的研发趋势是: (1)发展表达载体:目前最主要的用于生产的表达载体是哺乳动物细胞和大肠杆菌。大肠杆菌属于原核表达系统,没有糖基化功能,只能用于表达功能蛋白不需要糖基化的重组药物,如胰岛素等,且目的蛋白大量表达之后易形成包涵体,不易复性。而功能蛋白需要糖基化的则主要在哺乳动物细胞中表达。也有用真核化的原核表达载体[9]。目前还有“人源化”酵母表达体系和植物表达体系正在发展。(2)对现有的重组药进行基因工程改造和修饰:通过基因工程的改造和修饰使蛋白药物在临床应用上更安全更有疗效,如G-CSF和EPO等突变体药物研究与开发。目前,由于天然基因工程药物品种的研究已经相当普遍,因此采取对现有的重组药进行基因工程改造和修饰的策略,既可以避免侵犯知识产权,又可以为新药研究开辟出新途径。(3)改变给药途径:在继续改进注射用溶液和注射用无菌粉末的稳定性之外,还发展出化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。而在鼻腔、口服、直肠、口腔、肺部给药方面也已取得重大进展。 参考文献
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