一般认为,判定DNA纯度的方法可依据OD260/OD280大小判定:OD260/OD280≈1.8纯度较好(﹥1.9,表明有RNA污染;﹤1.6,表明有蛋白质、酚等污
染)。从OD260/OD280来看,酚/氯仿抽提法为1.52,含量小于1.6,说明有蛋白质、酚污染;异丙醇提取法和微波炉法分别为1.77和1.73,含量在1.6到1.9之间,说明质粒纯度很好;煮沸法为1.99,含量大于1.9,说明提取的质粒DNA中可能含有RNA杂质。从上表中可以看出各种方法提取质粒DNA的浓度顺序为:异丙醇提取法(195μg/mL)﹥酚/氯仿提取法(175μg/mL)﹥煮沸法(155μg/mL)﹥微波炉法(130μg/mL);由此可见,异丙醇法提取的质粒DNA纯度和浓度都是最高的。
酚/氯仿提取法
即为常规提取方法,在提取时分别按规定添加各溶液逐步使细菌溶解,然后加入酚/氯仿进行抽提,所得质粒DNA具有较高浓度,且纯度也可以,具有较高可行性,是常用的方法。但该方法的缺点在于酚/氯仿提取法中,用苯酚和氯仿进行抽提常常需要离心多次,使质粒DNA损失较大,产率低,操作步骤繁琐[7～8],而饱和酚和氯仿均有很大毒性和挥发性气味,带来诸多危险和不便。
异丙醇提取法
延续了常规的酚/氯仿提取法的优点,并用异丙醇代替酚/氯仿进行抽提,尽管异丙醇对蛋白质的变性能力低于苯酚和氯仿,但它能降低分子表面张力,减少抽提过程中所产生的泡沫同时有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋 白及下层有机溶剂相维持稳定,可以较高地去除质
粒DNA中的RNA和杂蛋白[9]。试验证明此方法快速、有效、便捷而且试验成本低,所提取的质粒DNA纯度和浓度都比较高,所提取的质粒DNA可以直接应用于转化细菌、细胞转染、PCR扩增、酶切分析和DNA重组等试验,并且结果稳定性好又经济,对试验设备要求不高,很大程度上节约了经费,同时去除了酚、氯仿,使试验本身对操作者的危害得以降低,非常适合大多数试验室使用。
煮沸法
较前两种方法简化了试验步骤,但剧烈过程较易破坏质粒DNA的结构,且在操作过程中往往很难控制煮沸的时间[10],使得所提取的质粒DNA纯度和产量都很低,提取的质粒DNA中会含有RNA,质粒DNA电泳都只出现微弱的条带。而且,煮沸不能完全灭活内切核酸酶的生理活性[11],不利于进行下一步的分子生物学试验。所以,煮沸法不太适合少量提取质粒DNA。
微波炉法
进一步简化了试验步骤,只需三次离心,大大缩短了提取质粒DNA的过程,且微波炉加热快捷,时间、温度易于控制,结果的重复性好,所得质粒纯度也很高。在一支eppendrof管中同时进行菌体裂解、DNA变性、蛋白质变性以及质粒DNA抽提全过程[12～13]
,节省试验用品,但本方法提取的质粒DNA浓度较低,在实际操作过程中很容易提取不到质粒。
结 论
异丙醇提取法所得质粒DNA浓度和纯度都很高,且试验所需成本低,方法便捷、有效、快速,重复性好,具有结果稳定的特点,可以进一步满足分子生物学试验要求,对试验设备、试剂都没有特殊的要求。因此是一种适宜常规试验室提取质粒DNA的简便方法
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