多重快速鉴别病原微生物的新技术_xMAP液态芯片

文章编号:100028020(2007)0620759204

卫　生　研　究

JOURNALOFHYGIENERESEARCHVol.36　No.6

　Nov.　2007759

・综述・

多重快速鉴别病原微生物的新技术:xMAP液态芯片

胡瑞　综述　王景林　审校

西北农林科技大学动物科技学院,杨凌　712100

1

摘要:多指标同步分析(FlexibleMulti2AnalyteProfiling,xMAP)液态芯片技术是美国Luminex公司近年来开

发的一种新型生物芯片技术。这种基于微球的芯片技术能够对单孔内多达100种不同的反应同时进行检测,与固相芯片或片膜芯片相比,具有多重、快速、灵敏度高(可达0101pg)、重复性好(CV<5%)以及检测动态范围宽(可达012～32000pgΠml)等优点。目前,该技术已被广泛应用于各研究领域,尤其在核酸、蛋白质和其他生物分子的大规模分析中。

关键词:多指标同步分析　液态芯片　微球　病原微生物　检测中图分类号:R15114　　　　　　文献标识码:A

Arapid,multiplexednewtechnologyxMAPliquidchipfor

detectionandidentificationofpathogens

HURui,WANGJinglin

CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling　712100,China

Abstract:xMAPliquidchipisanewbiochiptechnologydevelopedbytheLuminexcorporationinrecentyears.Thischiptechnologybasedonmicrosphereiscapableofsimultaneouslydetectingupto100differentanalytesinasinglereactionvessel.Incomparitionwiththesolidchipormembranechip,itpossessesthefeaturesofmulti2analytes,highsensitivity

(0101pg),goodreproducibility(CV<5%),widechannel(012-32000pgΠml),andsoon.Fortheseadvantages,thexMAPliquidchiptechnologyhasbeenusedinmanyfields,especiallyintheanalysisandidentificationofnucleicacid,proteinorotherbiologicalmolecules.

Keywords:xMAPliquidchip,microsphere,pathogens,detection

　　目前,基于微生物学、免疫学、生物化学和分子生物学发

展起来的病原微生物检测方法大致有以下几种:培养法、最大可能数法(MaximumProbableNumber,MPN)、免疫学方法、聚合酶链反应(PCR)和多重PCR(multiplexPCR)、实时定量PCR(real2timePCR)、寡核苷酸芯片检测法等。这些常规方法在病原检测中发挥作用,但上述方法也存在一定缺陷,如分离培养方法操作过程繁琐,灵敏度低;PCR只可对单一病原进行检测,且存在非特异性结合,以及假阴性和假阳性等问题;多重PCR虽可对几种病原进行检测,但因引物的不兼容性和高背景扩增等因素,影响了多重PCR的可重复性;目前采用的寡核苷酸芯片技术均是以固相载体为支持物的片膜芯片,虽然检测信息量大,但检测时会受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响,重复性不好,且无法实现定量检测。

病原微生物的传统检测方法由于上述缺陷往往会延误疾

基金项目:国家863计划资助项目(No.2006AA06Z414);国家自然科学基金资助项目(No.30671824)

作者简介:胡瑞,男,硕士研究生,研究方向:分子病原学与免疫学,E2mail:hurui2a@126.com

1通讯作者:王景林,军事医学科学院微生物流行病研究所病原

病的诊断、治疗及感染的控制,已经越来越不能满足现代检测的要求。因此,对于病原微生物急需开发一种快速、准确、灵敏度高、特异性强、高通量的检测技术,这不但可以有效预防和控制感染性疾病的发生,对于疾病的监测、临床诊断及治疗也有着很重要的指导意义。

1　xMAP液态芯片技术

20世纪90年代中期,美国Luminex公司将流式细胞仪、

微生物生物安全国家重点实验室,E2mail:wangjlin@bmi.ac.cn,

wangjl6481@hotmail.com

数字信号处理器和一种激光检测装置相结合,开发了一种具有多指标同步分析(xMAP)功能的芯片技术[1],也称为液态芯片(liquidchip)或悬浮芯片(suspensionarray)。xMAP液态芯片技术是对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模分析的一种新型检测技术,利用这种技术可实现对一份微量样品同时进行多达100种不同分析指标的检测,具有快速、操作简单、灵敏度高、重复性好、高通量等特点。该项技术不仅是病原、细胞因子、抗体等检测分析的重要工具,在基因表达和基因型分析研究中也有着不可估量的应用潜力。作为一种大规模的生物检测平台,它的优越性是其他现有的检测技术无法取代的,具有非常广阔的发展前景。

目前,xMAP液态芯片技术在国内的发展还刚刚起步,未得到足够的重视。国外利用此项技术已经开发了肿瘤标志

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物、过敏原筛查、自身免疫病、细胞因子等诊断微球,并且,2001年被美国食品及药物管理局(FDA)批准用于临床进行自身免疫病、人类白细胞抗原分型的诊断,这也是唯一被美国

[2]

FDA批准用于临床诊断的生物芯片。它的开发及应用被认为是生物芯片领域发展的一个重要进展,对开展病原微生物的快速鉴别、定量检测、临床诊断、食品安全控制等具有十分重要的意义。

μ的浓度)按照不同比例混合将直径为516m的聚苯乙烯乳胶

微球(microspheres)染成100种颜色,即得到100种不同地址标记的微球。每一种微球表面都带有活性羧基化基团,氨基标记的寡核酸探针就可通过化学反应共价结合到微球表面,蛋白也可以通过氨基与微球进行耦联。每种编码的微球可共价结合并携带一种可以捕获相应目标分子的生物探针,如抗原、抗体、核苷酸片段、受体、酶等。应用时,把针对不同检测物的寡核苷酸探针或蛋白质探针与羧基化的微球进行共价耦联,然后,使载有多种不同探针的微球混合物与待测标本在悬液中相互作用,特异性地结合待测样本中的目标分子(附图),并加上荧光标记。由于不同编码的乳胶微球可以放在同一个反应体系内,所以一小份样本可以被用来检测上百个指标[3]。

2　xMAP液态芯片基本原理

xMAP液态芯片技术与传统意义上的固相生物芯片技术

有所不同,该技术以流式细胞仪作为检测平台,创新性地将微球体作为反应的载体,并将反应置于液相环境中进行。首先,通过红色和橙色两种不同的荧光染料(每种荧光有10种不同

(左:双抗体夹心法检测抗原;右:杂交法检测核酸)

附图　xMAP液态芯片技术原理示意图

Figure　SchematicmapofxMAPliquidchip

　　流式细胞仪和数字信号处理器是主要的检测和分析设

备,可对多种微球进行实时检测。检测时,多种不同的微球排成单列通过两束激光对待测物进行检测,一束激光通过识别微球产生的特异性荧光从而区分是何种微球,并进而确定检测的是何种分子,即定性;另一束激光测定微球表面发生生物学反应后所产生的荧光信号强度从而决定待测物的量,即定量。所得到的数据经电脑处理后,结合软件分析即可直接用来判断结果。

312　重复性好,线性范围宽

xMAP液态芯片技术由于利用微球在溶液中反应,克服了

3　xMAP液态芯片的技术优势

311　灵敏度高

在反应体系中,由于每个乳胶微球表面都包被上许多核

酸分子或抗原、抗体,通过反应产生较强的信号,再加上激光检测技术的使用使检测更加精确、可靠,用极少量的样本就可进行检测。该技术的敏感性要优于常规检测方法,也高于常用的一些固相芯片检测方法,其灵敏度可达到0101pg。

片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响,检测结果可靠稳定,大大提高了样品检测的重复性。检测的重复性可以达到90%以上,并且线性范围也很

[4]

宽,可以达到012～32000pgΠml。313　快速省时

由于核酸杂交或免疫反应在均相的液体环境中进行,既有利于保持蛋白分子的天然构像,又有利于微球探针和待检测物的杂交反应,且反应后常不用洗涤就可以直接进行检测并得出结果,操作也比较简单,在一定程度上减少了反应所需时间,在35～60min内便可完成检测,所以检测效率大大高于固相杂交。目前,利用此项技术检测分析荧光微球的速度最高可达5000个Π秒。314　高通量

这种“多功能多指标同步分析”的技术与传统的单一检测

第6期胡瑞,等.多重快速鉴别病原微生物的新技术:xMAP液态芯片761　

方式有着很大的差别。通过在同一反应体系中放入许多不同

编码的微球,100种微球就可以标记上100种不同的探针分子,而每种编码微球对应一种待测指标,所以一次反应就可对一小份样品同时进行多达100种分析指标的检测,标本利用率大大提高,从而实现生物样品的高通量分析。

剂[18],通过PCR获得的待检模板混合物与杂交微球反应,定性定量检测了环境中384份样本,结果表明该法快速省时,灵敏准确,并且成本低廉。另外,MCBRIDE等利用该法在一份样本中对四种生物恐怖剂进行检测[19],并对每一指标进行检测条件优化及灵敏度检测,与ELISA方法相比较,结果很好地验证了该法动态范围宽、灵敏度高、特异性强等特点。

4　xMAP液态芯片技术的应用

由于xMAP液态芯片技术具有高通量、特异性强、快速、

灵敏等一系列优点,国外已经将该技术用于高通量核酸检测[5]、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)分析、过敏原筛查、自身免疫病、基因突变和基因表达的检测、抗

[6]

癌药物筛选、激素水平的测定、核受体与配体相互作用的分[7][8]析、单克隆抗体的筛选、肿瘤标志物以及关键生物分子如

[9]

抗原、抗体、细胞因子等的表达或活动水平的变化等研究,并逐步用于临床诊断。411　细菌及毒素的检测

自1977年美国科学家报道了液态芯片技术在免疫检测上应用以来,该技术应用范围越来越广泛。SPIRO等采用xMAP液态芯片技术检测了土壤、地下水等环境中微生物特异核酸序列[10]。结果表明,和常规方法相比,该技术具有更好的灵敏度和精确定量检测的优势。2003年,DUNBAR等检测了大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌等常见食源

[11]

性致病菌。根据细菌23SrDNA保守序列设计通用引物,扩增出86～109bp的生物素化待检模板,与载有特异探针的微球杂交后用Luminex芯片仪检测。结果表明,该方法比常规方法更快速、灵敏、准确。

在毒素检测方面的报道也很多,BENTANCOR等检测了D型产气荚膜梭菌毒素基因序列,结果经Southernblot验证吻合[12],并推测etx基因位于质粒上不同位置与ε毒素产量有关。BIAGINI等将xMAP液态芯片和ELISA两种技术同时用于检测人针对炭疽毒素产生的IgG抗体[13],并将两种方法进行比较,结果显示了xMAP液态芯片技术具有检测速度快,灵敏度高,检测范围广,样本需求量小等特点。412　病毒的检测

近年来,将xMAP液态芯片用于病毒检测也屡见报道,美国学者MARTINS检测了7种呼吸道病毒[14],并检测了病人82份样本中IgM的含量,其灵敏度达到非常好的水平。SMITH等快速定量检测了艾滋病病毒(HIV)、丙型病毒性肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)核酸,结果证明了该方法的快速、敏感、特异、高通量检测等特点[15]。2004年,OPALKA等将

[16]

xMAP液态芯片技术用于HIV21的抗体检测研究,该研究还将重组蛋白及生物素化抗原与两种不同微球结合的效果进行对比,结果也很好地验证了这种技术在抗体的多重检测上具有快速、灵敏等特点。最近,CLAVIJO等利用该方法在单一样本中同时检测了针对口蹄疫病毒的几种抗体[17],并与ELISA方法作比较,该方法具有更高的阳性检出率,而且敏感性好、效率高、可实现高通量检测,节省了检测时间和成本。此外,该技术用于多种传染性疾病,如变态反应性疾病、流行性腮腺炎、疱疹、麻疹、系统性念珠病等的检测也多见报道。413　生物恐怖剂的检测

2005年,WILSON等采用xMAP液态芯片技术检测了B1anthracis、Y1pestis、F1tularensis和B1melitensis四种生物恐怖

5　xMAP技术存在的问题

xMAP液态芯片技术在蛋白检测等方面已显示出很好的

优越性,但在核酸检测方面,对单管样本同时进行100种不同

分析指标的检测还很难实现,因为在使用多重PCR制备待检模板过程中,极有可能会遇到引物的不兼容、非特异性结合、高背景扩增、交叉杂交等情况,这些弊端就决定了很难在单管中进行过多的PCR反应,也就无法同时检测过多的指标,这在很大程度上给该项技术的高通量检测带来不便。近年来,HANJ博士建立了一种基于超级引物的Templex多重PCR方法[20],该方法很好地解决了普通多重PCR中引物不兼容和高背景扩增等弊端,实现了在单管中通过一次多重PCR反应,即可完成对多种核酸靶序列的同时扩增,从而为xMAP液态芯片技术的运用提供极大便利。在菌株型鉴定、血清型和抗药基因研究上仍有不足之处。近年来,一些新的病原微生物不断出现,加上血清型变异、耐药性菌株的增加等均给xMAP液态芯片技术的检测带来困扰。另外,需要对交联条件和多种分子混合液反应条件(如缓冲液、温度、作用时间等)的优化、混合交叉反应的避免,以及对大量的数据进行合理、有效

[21]

的分析等。

6　结语与展望

xMAP液态芯片技术作为继平面芯片(基因芯片、蛋白质芯片)之后的一种新型检测型生物芯片技术,其最大的优越性

在于可以用于高通量多指标同步分析。该技术创新性地将细胞大小的微球作为探针的载体,并为生物分子相互作用提供一种能够充分反应的液相环境,同时将激光检测、高速数字信号处理器应用到该技术中,使这种技术既具有以往生物芯片高通量的特性,又具有优于传统芯片的操作简便,重复性好、灵敏度高等特点。从xMAP液态芯片的技术方案来看,在一种样品中检测靶分子的数量、检测速度、自动化程度、以及应用范围等仍有很大的发展空间。例如,我们若采用三种颜色的荧光染料来标记微球,就可实现每份样品可同时检测多达1000种指标。另外,我们可以对机器及检测方案等进行优化,以实现更广的应用范围、更高的灵敏度、更快的检测速度,更简便的操作程序等。

综上所述,xMAP液态芯片技术可以作为一种新方法用于临床实验室诊断。这项技术的发展和应用,将最终彻底改变临床病原微生物检验的现状和传统观念,实现高效、高质和廉价的统一。xMAP液态芯片技术以其高通量、快速、灵敏、重复性好等显著的优越性作为生物信息学一种先进的大规模生物检测平台,必将有着更广阔的发展及应用前景。

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