一种灭活酵母菌注射剂[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108524925 A(43)申请公布日 2018.09.14

(21)申请号 201810359624.0(22)申请日 2018.04.20

(66)本国优先权数据

201810292233.1 2018.04.03 CN

(71)申请人 潍坊华英生物科技有限公司

地址 261108 山东省潍坊市滨海经济技术

开发区海丰路004669号

申请人 山东农业大学(72)发明人 张勇　石有斐　

(74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理

有限公司 11129

代理人 马明耻(51)Int.Cl.

A61K 39/00(2006.01)A61K 36/0(2006.01)

()发明名称

一种灭活酵母菌注射剂(57)摘要

本发明涉及一种增强免疫功能、抗菌和抗病毒的注射剂，属于生物医药领域。这种药物的主

通过将活的酵母菌灭活制要成分是灭活酵母菌，

备得到。灭活酵母菌注射给药可以增强机体免疫功能，并具有抗菌、抗病毒作用，可用于人或动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病以及各种原因引起的机体免疫功能低下等多种疾病的预防、治疗或辅助治疗，具有广阔的应用前景。

A61P 31/04(2006.01)

A61P 31/12(2006.01)A61P 37/04(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图1页

CN 108524925 ACN 108524925 A

权　利　要　求　书

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1.一种增强免疫功能、抗菌和抗病毒的注射剂，该注射剂的主要成分为灭活酵母菌，其特征在于，对所述的灭活酵母菌进行革兰氏染色，在油镜下观察，灭活酵母菌保持完整菌体形态，每ml注射剂包含灭活酵母菌数量为105—1012个,所述注射剂为混悬液，给药方式为注射给药。

2.如权利要求1所述的注射剂，其特征在于，所述的酵母菌为酿酒酵母(拉丁名称：Saccharomyces cerevisiae，保藏编号：CICC1012)。

3.如权利要求1所述的注射剂，其特征在于，所述的酵母菌为德尔布有孢圆酵母(拉丁名称：Torulaspora delbrueckii，保藏编号：CICC1004)。

4.如权利要求1所述的注射剂，其特征在于，所述的酵母菌选自酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的注射剂，其特征在于，灭活方法选自高温灭活、高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种。

6.根据权利要求1所述的注射剂，其特征在于，所述的注射剂还包含药学上可接受的佐剂，佐剂中含有足够的盐或单糖以保证注射剂悬浮液与血液渗透压相同或相近。

7.根据权利要求1所述的注射剂，其特征在于，所述的注射剂通过喷雾干燥或冷冻干燥制作成粉针剂，应用时配制成混悬液。

8.根据权利要求1-7任一项所述的注射剂，其特征在于，所述注射剂可以静脉给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、瘤内注射给药。

9.如权利要求1-8所述的注射剂在制备增强免疫功能、抗菌和抗病毒药物中的用途。

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说　明　书一种灭活酵母菌注射剂

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技术领域

[0001]本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种增强免疫功能、抗菌和抗病毒的注射剂。背景技术

[0002]目前研究发现酵母菌具有调节肠道平衡、促进饲料转化以及提高机体免疫功能等良好的益生特性，多作为饲料添加剂用于畜禽养殖。有研究将酵母作为饲料添加剂用于增强猪的免疫功能(专利公开号：CN106387398A)。另外，将酵母提取物或其有效成分(如酵母多糖、酵母甘露寡糖、酵母β-葡聚糖)用于提高机体免疫功能的研究较多(参考文献[1]：Molist F，Eerden E V，Parmentier H K，Vuorenmaa J.水解酵母提取物对断奶仔猪免疫功能和生长性能的影响.饲料博览，2014，12：32.参考文献[2]：丁鹏，胡贵丽，刘勇强，宋泽和，范志勇，贺喜.酵母甘露寡糖对猪鸡生产性能和免疫功能的影响.2017，5：24-26.参考文献[3]：朱娅敏，张海波，夏长虹，张彦，张小丽.酵母β-葡聚糖对小鼠免疫力增强作用的研究.食品与发酵科技，2016，52(2)：1-2.)。另外，还有人将酵母葡聚糖进行化学修饰后制成硫酸化或羧甲基酵母葡聚糖注射剂，用于增强动物的免疫功能(专利公开号：CN102028704A，CN102048686A)。

[0003]以往我们研究发现将灭活的乳酸菌对小鼠、牛、猪、狗等动物静脉给药具有良好的免疫增强、抗菌和抗病毒等作用，并申报了国际和国家多项发明专利(专利申请号如下：PCT/CN2016/09844，201610809584.6，201610811028.2，201610810757.6，201610810758.0，201610809345.0，201610809582.7，201610809583.1，201610809676.4，201610811285.6，201610811770.3)。基于以上的研究，我们推测将酵母菌灭活制成注射剂对动物注射给药也应该具有免疫增强作用，通过文献和专利数据库查阅发现，目前尚无这样将酵母菌直接灭活作为注射剂的报道，我们研究发现将酵母菌灭活作为注射剂对动物给药具有良好的免疫增强和抗菌、抗病毒作用。该药物对动物用药还具有成本低、无药物残留等优势，特别对家畜疫病防控具有广阔的应用前景。

发明内容

[0004]一种增强免疫功能、抗菌和抗病毒的注射剂，该注射剂的主要成分为灭活酵母菌，对注射剂中的灭活酵母菌进行革兰氏染色，在油镜下观察，灭活酵母菌保持完整菌体形态，与其灭活前活菌的菌体轮廓和形态一致。

[0005]所述的注射剂每ml注射剂包含灭活酵母菌数量为105—1012个。[0006]所述的酵母菌选自酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属。

[0007]进一步，酵母菌的灭活方法选自高温灭活、高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种。[0008]再进一步，所述的注射剂还包含药学上可接受的佐剂，佐剂中含有足够的盐或单

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说　明　书

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糖以保证注射剂悬浮液与血液渗透压相同或相近。[0009]用于本发明的制备灭活酵母菌注射剂的剂型包括：粉针剂、混悬注射剂等。所述的粉针剂通过喷雾干燥或冷冻干燥制成，应用时制成混悬液。[0010]所述制剂为注射剂。[0011]优选的，所述灭活酵母菌为单一菌，对灭活酵母菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察，灭活酵母菌保持完整菌体形态，与其灭活前活菌的菌体轮廓和形态一致，药物的给药方式为注射给药。[0012]进一步，所述灭活酵母菌为两种以上灭活酵母菌混合物，对灭活酵母菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察，主要为保持完整菌体形态的灭活酵母菌，药物的给药方式为注射给药。利用高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种灭活方法得到所述灭活酵母菌。所述的酵母菌选自酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属。

[0013]所述的注射剂的佐剂选自辛苯氧基聚乙氧乙醇、四丁酚醛、山梨醇酐聚乙二醇单油酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯衍生物、吐温-80、聚烷基苯磺酸钠、月桂基硫酸酯钠、多糖硫酸酯碱金属盐、葡聚糖硫酸酯钠、磺基琥珀酸双辛酯、金合欢胶、阿拉伯乳胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅酸乙酯、乙醇、甘油、山梨醇、蜂蜜、琼脂、淀粉、右旋糖、果糖、麦芽浸膏、可可粉、酒石酸、枸橼酸、枸橼酸钠、角叉酸、海藻酸、海藻酸钠、鞣酸、环己烷氨基磺酸、矿物油、优卡林、糖精钠、印度树胶、刺梧桐树胶、西黄蓍胶、果胶、鹿角菜胶、明胶、羧甲基纤维素、硫酸纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、醋酸硫酸纤维素钠、羟乙基纤维素钠、甲基聚硅、山梨酸钾、高岭土、硅藻土、膨润土、硅酸铝、氢氧化铝、胶体氢氧化铝、硅酸镁铝、蒙脱土镁、三聚硅酸镁、硅酸铝镁钠、碳酸氢钠、碳酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、乙基香草醛、柠檬油、橙皮油、香草醛、干酪素等。[0014]优选的，本发明所述的酵母菌选自：酿酒酵母(拉丁名称：Saccharomyces cerevisiae，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；保藏编号：CICC1012)、德尔布有孢圆酵母(拉丁名称：Torulaspora delbrueckii，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；保藏编号：CICC1004)。分别对以上2种酵母菌进行常规方法灭活，然后对小鼠静脉给药，发现以上2种灭活酵母菌静脉给药均可增强小鼠机体免疫功能，并具有抗菌和抗病毒作用。[0015]本发明所述的灭活酵母菌注射剂可用于人或动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、真菌性疾病、寄生虫病、癌症以及各种原因引起的机体免疫功能低下等多种疾病的预防、治疗或辅助治疗。

[0016]此前没有人尝试用灭活酵母菌注射给药用于提高机体免疫功能、抗菌和抗病毒的研究，可能主要考虑灭活酵母菌注射给药存在安全性问题，与日常使用的水溶性静脉注射剂相比较，灭活酵母菌注射剂呈颗粒性混悬液，将这样的颗粒性物质进行注射给药，认为风险较高。但目前人医临床上已经有将有害菌的菌体进行注射给药的药物，如卡介苗，是结核活菌苗，可通过口服、皮下、腹腔或瘤内注射用于预防结核病和肿瘤的辅助治疗。短小棒状杆菌制剂，为短小棒状杆菌的死菌悬液，经皮下、肌肉、瘤内或静脉滴注等用于一些肿瘤的辅助治疗。此外，还有A群链球菌制剂、铜绿假单胞菌制剂、草分枝杆菌制剂等。另外，还有人将红球菌属、戈登氏菌属、诺卡氏菌属、迪茨氏菌属、冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细

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菌细胞注射给药作为免疫调节剂(专利公开号：CN17331A)。[0017]而本发明经过研究发现，灭活酵母菌静脉注射具有提高免疫功能和防治细菌病、病毒病的作用。酵母菌作为一种益生菌将其灭活注射给药具有更安全的特性。注射灭活酵母菌能够提高机体免疫功能的机制可能是当灭活酵母菌注射给药后，机体将灭活酵母菌的菌体作为外来物质识别，为了将其清除掉，从而增强了机体免疫功能；也有可能是保持完整菌体形态的灭活酵母菌与免疫细胞接触，作用于免疫细胞上Toll样受体，从而激活免疫系统。灭活酵母菌注射给药具有抗菌和抗病毒作用可能是增强了机体免疫功能的结果，也有可能是灭活酵母菌注射给药后被机体分解代谢后产生的物质发挥的作用。附图说明

[0018]图1活的酿酒酵母革兰氏染色油镜观察照片[0019]图2灭活酿酒酵母革兰氏染色油镜观察照片

具体实施方式[0020]实施例1

[0021]将酿酒酵母(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；拉丁名称：Saccharomyces cerevisiae，保藏编号：CICC1012)接种于培养基(称取20g蛋白胨，20g葡萄糖，10g酵母粉，加水至1000mL,121℃灭菌20min制备)，于37℃恒温振荡器中以160r/min的转速培养24小时，然后3000转离心5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心5分钟，重复清洗3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成混悬液。取一定量的酿酒酵母菌生理盐水混悬液，经过THOMA细菌计数板进行细菌计数，使每1ml混悬液含有109个酿酒酵母菌体。将配制好的酿酒酵母生理盐水混悬液于121℃、压力0.12MPa，灭活15min，得到灭活酿酒酵母注射剂。将活的酿酒酵母和灭活的酿酒酵母分别进行革兰氏染色，在油镜下观察菌体形态(参见附图1和附图2)，对比发现，灭活菌与活菌保持一致的菌体轮廓和形态,细菌计数发现灭活前后菌体数量未发生明显变化。对灭活酿酒酵母生理盐水混悬液进行离心，弃上清留沉淀，提取DNA，采用PCR扩增16S rDNA，通过测序还可以进行酵母菌种类鉴别。[0022]实施例2

[0023]将德尔布有孢圆酵母(德尔布有孢圆酵母，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；拉丁名称：Torulaspora delbrueckii，保藏编号：CICC1004)接种于培养基(称取20g蛋白胨，20g葡萄糖，10g酵母粉，加水至1000mL,121℃灭菌20min制备),于37℃恒温振荡器中以160r/min的转速培养24小时，然后3000转离心5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心5分钟，重复清洗3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成混悬液。取一定量的德尔布有孢圆酵母菌生理盐水混悬液，经过THOMA细菌计数板进行细菌计数，使每ml混悬液含有109个德尔布有孢圆酵母菌体。将配制好的德尔布有孢圆酵母菌生理盐水混悬液于121℃、压力0.12MPa，灭活15min，得到灭活德尔布有孢圆酵母菌注射剂。[0024]实施例3

[0025]采用碳粒廓清试验方法分别检测实施例1制备的灭活酿酒酵母注射剂和实施例2制备的灭活德尔布有孢圆酵母注射剂对正常小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有

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孢圆酵母注射剂组。每组10只小鼠，雌雄各半。正常对照组小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，灭活酿酒酵母注射剂组小鼠尾静脉注射灭活酿酒酵母混悬液，灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组小鼠尾静脉注射灭活德尔布有孢圆酵母混悬液。以上各组给药体积均为0.1mL/10g，连续尾静脉注射5天，每天1次。末次给药2小时后，小鼠尾静脉注射印度墨汁0.05mL/10g，于1min和10min分别从眼眶静脉丛采血40μL，加到4mL 0.1％Na2CO3溶液中摇匀，用分光光度计在680nm波长下比色，测定光密度(以下分别用OD1和OD10来表示1min和10min所取血样的光密度)，按下式计算碳廓清指数K值。碳廓清指数K＝(lgOD1-lgOD10)/(t10-t1)。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表1。由表1可知，与正常对照组相比较，灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组分别显著和极显著提高了碳廓清指数K值。以上说明，将灭活酿酒酵母和德尔布有孢圆酵母静脉给药可以提高正常小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能，即提高了小鼠的非特异性免疫功能。

[0026]表1灭活酵母菌静脉注射对正常小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响结果

[0027]

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照组比较差异

显著P＜0.05。[0029]实施例4

[0030]分别采用碘[125I]肿瘤坏死因子-α放射免疫分析试剂盒和碘[125I]干扰素-r放射

免疫分析试剂盒检测实施例1制备的灭活酿酒酵母注射剂对小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含

量的影响。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表2。由表2可知，与正常对照组相比较，灭活酿酒酵母注射剂组极显著提高了小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量。[0031]表2灭活酵母菌静脉注射对小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量的影响结果

[0032]

[0028]

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照组比较差异

显著P＜0.05。[0034]实施例5

[0035]检测实施例1制备的灭活酿酒酵母注射剂和实施例2制备的灭活德尔布有孢圆酵母注射剂对沙门氏菌感染小鼠的防治作用。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为4组，即正常对照组、沙门氏菌组、灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组，每组30只小鼠，雌雄各半。正常对照组和沙门氏菌组的小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组分别尾静脉注射剂量为0.1mL/10g相应注射剂。给药后间隔24小时，沙门氏菌组、灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组的小鼠分别尾静脉注射肠炎沙门氏菌(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，编号CVCC 3377)。连续观察20天，记录小鼠每天的死亡数。采用SPSS11.5软件对实

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验数据进行卡方检验，结果见表3。由表3可知，与沙门氏菌对照组比较，灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组均极显著地降低了小鼠的死亡数。说明灭活酿酒酵母注射剂和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂静脉给药对感染沙门氏菌的小鼠具有防治作用。[0036]表3灭活酵母菌静脉注射防治沙门氏菌对小鼠致死作用的结果

[0037]

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照常组比较差

异显著P＜0.05；△△表示与沙门氏菌组比较差异极显著P＜0.01，△表示与沙门氏菌组比较差异显著P＜0.05。[0039]实施例6

[0040]检测实施例1制备的灭活酿酒酵母注射剂和实施例2制备的灭活德尔布有孢圆酵母酵母注射剂对流感病毒PR8株感染小鼠死亡数的影响。实验选用18-22g清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、PR8株模型组(即流感病毒PR8株感染小鼠模型组)、灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组。每组30只小鼠，灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组分别尾静脉注射体积为0.1ml/10g的相应注射剂；正常对照组和PR8株模型组尾静脉注射无菌生理盐水，各组给药体积均为0.1mL/10g。各组小鼠于给药1次后间隔24小时，除正常对照组外，其他各组小鼠在乙醚轻度麻醉下于鼻腔内接种含流感病毒PR8株的鸡胚尿囊液，每只0.05mL，使流感病毒PR8株感染小鼠。此后观察记录10天内各组小鼠死亡数。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行卡方检验，结果见表4。由表4可知，灭活酿酒酵母注射剂组和灭活德尔布有孢圆酵母注射剂组与PR8株模型组比较，分别极显著和显著降低了小鼠死亡数。以上说明灭活酿酒酵母和灭活德尔布有孢圆酵母静脉给药可以用于病毒性疾病防治。

[0041]表4灭活酵母菌静脉注射对流感病毒PR8株感染小鼠的影响结果

[0042]

[0038]

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照常组比较差

异显著P＜0.05；△△表示与PR8株模型组比较差异极显著P＜0.01，△表示与PR8株模型组比较差异显著P＜0.05。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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