果蝇翅形、刚毛、眼色三对性状的三点测交与遗传作图

果蝇翅形、刚毛、眼色三对性状的三点测交与遗传作图

唐浩能 13335155

（中山大学生命科学学院生物技术 2013级 广州 510006）

摘要：基因的连锁与互换定律是遗传学的第三大基本定律，通过三点测交实验我们可以很好的反映该定律。本实验以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为实验材料，以果蝇X染色体上三对非等位基因的交换行为来验证基因在染色体上呈直线排列。实验中我们以野生型（长翅，直刚毛和红眼）和三隐性（短翅，卷刚毛和白眼）果蝇为亲本材料进行杂交，在F2代中观察到8种表型。同时，通过计算三点测交F2代8种表型的相对频率，我们可以计算出重组值，进而确定出三基因的排列顺序。从而最终实现了这三对基因遗传图的制作和基因定位。

关键词：果蝇；三点测交；遗传作图；基因定位

引言

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）属双翅目昆虫，具有完全变态。作为实验材料具有如下优点：①生长迅速，周期短，在25℃条件下，10~12d可完成一个世代；②繁殖力较强，每只雌果蝇可以产卵400~500枚，因而可以在短时间内获得多数子代，有利于做遗传学统计分析；③饲料简便易得，容易饲养，成本低，实验所需空间较小，条件简单，容易管理；④突变性状多达400个以上，并且多数是形态变异，便于观察和统计分析；⑤染色体数目少，突变基因容易在染色体上定位。利用黑腹果蝇可以很好的用来进行基因的连锁与互换定律的验证。其中所用到的的性状为翅形（长翅、短翅）、刚毛类型（直刚毛、卷刚毛）和眼色类型（红眼、白眼）三对性状。这三对非等位基因都位于X染色体上。通过观察F2代表型，可以很好的判断三个基因的连锁关系和遗传图距[1]。

4.1 实验目的

1. 学习和掌握用“三点测交”进行基因定位的方法。 2. 了解绘制遗传学图的原理和方法。

3. 加深对重组值、遗传学图、双交换值、并发率和干涉等概念的理解。

4.2 实验原理

位于不同染色体上的两对基因，它们所决定的两对相对性状在F2是自由组合的。而位于同一染色体上的基因则是连锁的，同源染色体的基因之间可以发生交换。使子代出现一定数量的重组型，重组型出现的多少反映出基因间发生交换的频率的高低。根据基因在染色体直线排列的原理，基因间距离越远，期间发生交换的可能性越大，即交换频率越高；反之则小，交换率就低。因此交换值的大小就可以用来表示基因间距离的长短。但交换值无法直接测定，而只有通过基因之间的重组来估计所发生交换的频率，所以通过计算重组值的大小，就能反映基因间距离的大小[2]。

基因图距是通过重组值的测定而得到的。如果基因座相距很远，重组率与交换率的值相等，可以根据重组率的大小作为有关基因间的相对距离，把基因顺序地排列在染色体上，绘制出基因图。但在基因间相距较远的情况下，两个基因间往往会发生两次以上的交换，这时

1

如果简单地把重组率看做交换率，就会低估了交换率，图距也会随之缩小，因此需要利用实验数据进行校正，以便正确估计图距。根据这个道理，可以确定一系列基因在染色体上的相对位置。

本实验通过对同一染色体上3个非等位基因的交换行为来验证基因在染色体上呈直线排列。先用野生型果蝇（长翅、直刚毛、红眼）与三隐性果蝇（白眼、短翅、焦刚毛）杂交，制成三因子杂种，再把雌性杂种与三隐性个体测交，在测交后代中由于基因间的交换可得到8种不同的表型，经过数据处理，绘制出遗传学图，这样一次实验便可以测出3个连锁基因在染色体上的距离和顺序，就叫做三点测交或三点试验。

三隐性果蝇（m sn3 w）具有短翅（m 翅长至腹部末端）、卷刚毛（sn3）和白色复眼（w），这3个基因都在X染色体上。

F1的雌蝇表型是野生型，雄蝇是三隐性。得到的测交后代，其中多少个体与原来亲本相同。同时会出现少量与亲本不同的个体，称为重组型,是基因间发生交换的结果。（如图1~2）。

m sn3 w + + +

P

野生型♂ 三隐性♀ F1

m sn3 w + + +

三因子杂种♀

测交后代

图1三点测交的交配方式

三隐性♂

m sn3 w

图2 三因子杂种中基因发生交换产生的8种不同配子

因为重组值是表示基因间的交换频率，而图距表示基因间的相对距离，通常是由两个邻近的基因图距相加得来的，所以图距往往不等同于重组值。图距可以超过50%，重组值只会逐渐接近而不会超过50%，只有基因相距较近时，图距才和重组值相等[3]。

2

4.3 实验材料、仪器和试剂

4.3.1 实验材料

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）：18#品系野生型果蝇（+++）红眼、长翅、直刚毛；6#品系三隐性果蝇（m sn3 w）短翅、卷刚毛、白眼。

4.3.2 实验仪器

恒温培养箱，电炉，培养瓶，麻醉瓶，解剖镜，毛笔，镊子。

4.3.3 实验试剂

乙醚，丙酸，酒精棉，琼脂，酵母，红糖，麸皮。

4.4 实验方法和步骤

1. 收集和挑选6#品系三隐性品系处女蝇，同时也收集和挑选野生型雄蝇。在挑选过程中，

注意麻醉瓶、白瓷板、毛笔等用具要提前用烘箱干热（60℃烘4h以上）消毒，使用时用酒精棉球擦拭白瓷板、毛笔，且晾干后方可使用，以防污染。

2. 把挑选到的三隐性雌蝇和野生型雄蝇，各5只，用毛笔扫进空白培养瓶中杂交，注意果

蝇还没有苏醒前，瓶子要水平放置，以免在麻醉中的果蝇沾到培养基或水珠而被闷死。贴好标签，放在25℃培养箱里培养。 杂交标签如下：

P：m sn3 w × +++ （♀）品系号 （♂）品系号 杂交日期： 班级： 姓名： 3. 4. 5. 6.

经7d出现F1幼虫，倒干净亲本成虫并处死。

再7d，F1成蝇出现，将成蝇倒进消毒过的空瓶适度麻醉，可以观察到F1雌蝇全部是野生型表型，雄蝇都是三隐性。然后选6对F1果蝇，放到新的培养瓶中继续杂交。 7d后F2幼虫出现，这时要把F1成蝇全部倒出并处死。

再继续培养7d，F2成蝇出现，可以开始观察。先把F2成蝇倒进空瓶进行适度麻醉（如果深度麻醉会令长翅、短翅难于分辨），依F2各种表现型性状，用体视显微镜检查眼色、翅形和刚毛并做好记录，观察可以持续7d，再迟F3成蝇可能出现，此时不能继续观察，以免影响实验的准确性，本实验一般要求至少观察和统计约250只果蝇。

4.5 实验结果记录

4.5.1 F2代果蝇各性状观察和个体数统计

将实际观察到的测交后代8种表型的果蝇数量，进行汇总。 我们对数据合并后，得到如下汇总表格（表1）：

表1 三点测交试验F2性状观察和统计 测交后代表型 sn3 w m + + + 观测数 重组发生在 m~sn3 3

m~w w~sn3 40 26

+ w + sn3 + m sn3 + + + w m + + m sn3 w + 总计 23 32 19 22.33% 31.07% 18.45% 重组值/% 先把实际所得到的F2代8种表型观察数据填上，计算总数。 填写“基因重组发生栏”并作统计。在实验中，由于测交亲本是三隐性，如果基因间有交换，在表型上就能显示出来，所以，通过测交后代的表型就能够推断出某两个基因是否发生重组。

9 5 1 4 10 8 103 + + + + + + + + + + + + 4.5.2 计算基因间的重组值

m~sn3间的重组值=23/103×100%=22.33% m~w 间的重组值=32/103×100%=31.07% w~sn3间的重组值=19/103×100%=18.45%

4.5.3 画出遗传学图（图3）

m

22.33

sn3

18.45

w

31.07

图3 X染色体上三基因的定位

从图3中可以看出，m~w间的重组值小于m~sn3间和sn3~w间的重组值之和，通过计算双交换值就会发现：这是因为两个相距较远的基因发生了双交换的结果。而这种发生了双交换的果蝇在基因顺序还没弄清楚，也就是遗传学图还并没有画出时，是难以确定的。当遗传学图画出来后，就能明显看到m~w间发生了双交换，并产生了两种表型的果蝇：m+w（小翅、直刚毛、白眼）和+sn3+（长翅、卷刚毛、红眼）。这两种果蝇计有5只，由于在计算m~w间的重组值时这个值没有被计算进去，所以两个相距较远的基因的重组值被低估了。

由此在这里可以把低估的值计算出来：

5/103×100%=4.9%

因为是双交换，所以要乘以2，得4.9%×2=9.8%，这就是校正值，把校正值加m~w间的重组值所得的和画图，就是实际的基因图距（图4）

m

22.33

sn3

18.45

w

40.87

4

图4 加双交换值（校正值）后的遗传学图

4.5.4 计算并发率和干涉

如果两个基因间的单交换并不影响临近两个基因的单交换，那么预期的双交换频率应等于两个单交换频率的乘积。但实际上观察到的双交换频率往往低于预期值。因为每发生一次单交换，它临近也发生一次交换的机会就会减少一些，这叫做干涉。一般用并发率表示干涉的大小。

计算并发率和干涉：

并发率=

两个单交换频率的乘积干涉=1-并发率

在本实验中：

4.9%

=1.19

22.33%×18.45%干涉=1-1.19=-0.19

由于并发率为1.19，大于1.00，两个单交换之间的干涉为负值，这暗示每发生一次单交换，它临近也发生一次交换的机会反而增加了一些。我们将在后文对这个有悖于以往实验结果的数据作出反思与解释。

并发率=

观察到的双交换频率

4.6 实验结果分析与讨论

通过我们小组的数据，我们最终确定出了在本次试验中，该品系组果蝇X染色体上三对非等位基因的相对位置关系为：翅形（长翅和短翅）—刚毛类型（卷刚毛和直刚毛）—眼色（白眼和红眼）。并且相对遗传图距分别为翅形和刚毛类型基因相距22.33，刚毛类型和眼色基因相距18.45，翅形和眼色基因相距40.87。并且翅形和颜色基因的遗传图距是经过双交换修正了的。双交换发生率实际为4.9%，和理论发生率十分接近。通过计算并发率发现，并发率为1.19，大于1.00，即发生了负干涉。

基于上述实验统计结果，我们发现，翅形、刚毛、眼色三对性状基因发生了负干涉。我们猜测有可能是由如下原因造成：

1) 样本数据量太少，有些性状组合如卷刚毛、红眼、长翅（sn3 + +）果蝇数量只有1只，以致统计误差较大。 2) 在实验中，我们发现翅形的长短很难做出正确判断，因此很有可能是我们在计数时将部分翅形单交换数据计入了不交换数据组中，最终导致了这两组数据的记录人为误差；实验中，我们建议在麻醉中切勿麻醉过度，导致翅膀翘起，影响判断观察。

3) 在实验中，我们发现除了翅形辨别比较考验技术外，更容易犯错误的地方是刚毛类型。由于卷刚毛表型过于不明显，使得在观察时很容易误认为是直刚毛类型。建议在日后的实验中，选择像眼色这样更加易于观察的质量性状基因作为三点测交定位基因。

总体来说，本次试验我们掌握了三点测交和遗传作图的方法和技巧，相信在日后的实验中能够得以改进，进而快速有效的找到基因定位的遗传学方法。

参考文献

[1] 王金发, 戚康标等.《遗传学实验教程》.第一版, 北京：高等教育出版社，2012. 19~34. [2] 王金发,何炎明.2011.细胞生物学实验教程.[M].2版.北京：科学出版社. [3] 贺竹梅.现代遗传学教程[M]. 2版.北京：高等教育出版社.

5

Three-point Testcross and Gene Mapping of wing type, bristles type

and eye color of Drosophila melanogaster

Tang Haoneng 13335155

（Biotechnology，School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, P.R.China）

Abstract: Linkage inheritance and crossing-over is the third most basic law of genetics. We can proof this law through three-point testcross experiment. And in this experiment, we used Drosophila melanogaster as the meterial. Through observing three pairs of non- allelic behavior on X chromosome, we justified the fact that genes are arranged in a line on the chromosome. Among experiment, we used wild type (Long-winged, straight bristles and red-eye) and the recessive (short wings, roll bristles and supercilious) as the parental generation, then observed the F2 offspring, which had 8 phenotypes. At the same time, through calculating the relative frequencies of the 8 phenotypes of F2, we could calculate the reorganization value, and then determining the order of the three genes. And ultimately we achieved these three pairs of genes’ genetic map production and gene mapping.

Key words: Drosophila melanogaster; Three-point testcross; Genetic mapping; Gene mapping

m sn3 w + + +

P

m sn3 w + + +

m sn3 w

F1

测交后代

附图1 三点测交的交配方式

6

三种不同的交换形式产生6种重组型

m sn3 w

+ + + m sn3 w m + + + sn3 w + + + I种

m sn3 w + + + m sn3 w m sn3 + + + w + + + II种 2：重组性状产生的机理

7

m sn3 w

+ + + m sn3 w m + w + sn3 + + + + III种 附图