原发性肝细胞癌组织中P21的亚细胞定位及其意义_易玲

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原发性肝细胞癌组织中P21的亚细胞定位及其意义

易

玲

邱荣元

王松柏

刘崇梅

冯喜华

万焱鑫

伍小琼

何生松

【摘要】目的探讨原发性肝细胞癌组织中P21的亚细胞定位及其意义。方法收集115例由肝硬化发展成肝癌HCC组和癌旁组均有P21的

的病理标本，包括同一病例的肝癌组织、癌旁组织、肝硬化组织。采用SP法分别行P21的免疫组织化学染色，观察P21的亚细胞分布，并对其与肝癌的临床病理特征、癌细胞分化程度进行相关性分析。结果

38．26%），P＜0．01）。P21高表达（35．65%，两者之间的差异无统计学意义（P＞0．05），但明显高于肝硬化组（10．43%，6．82%，P＞0．05），P＜胞质表达的阳性率，肝硬化组与癌旁组相近（8．33%，而肝癌组胞质表达的阳性率最高（75．61%，0．01）。P21的亚细胞定位分布与肝癌患者的发病年龄、乙肝病毒的感染、肿瘤大小无明显相关性（P＞0．01或0．05），但与肿瘤细胞的病理分级、肿瘤转移具有良好的相关性。Ⅲ-Ⅳ级、伴有肿瘤转移的肝癌患者，其P21的胞质表达率更高。结论关。

【关键词】P21；亚细胞定位；胞核；胞核；肝癌；肝硬化DOI：10．3969/j．issn．1001-5930．2013．06．004中图分类号：Ｒ735．7

文献标识码：A

5930（2013）06-0593-03文章编号：1001-在肝硬化向肝癌转化的过程中，伴有P21亚细胞定位的改变，即由胞核移位到胞质，且肿瘤细胞恶性程度愈高，肿

瘤转移愈早，胞质移位比例愈高。但这种亚细胞定位分布的改变，与肿瘤患者的发病年龄、乙肝病毒的感染、肿瘤大小无

SubcellularLocalizationofP21inHepatocellularCarcinomaanditsClinicalSignificance

YILing，QIUＲongyuan，WANGSongbai，etal．

【Abstract】ObjectiveMethods

YueyangPeople＇sHospital，HunanNormalUniversity，Yueyang，414000

TostudysubcellularlocalizationofP21inHepatocellularcarcinomaanditsclinicalsignificance．

115specimensofHCCbasedonlivercirrhosiswereexamined，includingHCCtissues，cirrhosisoflivertissuesandpa-

racanceroustissuesofthesamespecimen．SpecimenswereperformedHEstainingandtheexpressionofP21proteinwasexaminedbyimmunohistochemistry（S-Pmethod），itssubcellularlocalizationwasobservedandcorrelationwithclinicalandpathologicalfea-tureswasexamined．Ｒesults

ThepositiverateofP21inHCCtissueswassimilarwiththatofparacanceroustissues（35．65%vs

P＞0．01），andsignificantlyhigerthanlivertissuesofcirrhosis（10．43%，P＜0．01）．Thepositiverateincytoplasmof38．26%，

P21incirrhosistissueswassimilarwiththatofparacanceroustissues（8．33%vs6．82%，P＞0．01），andsignificantlylowerthanthatinHCCtissues（75．61%，P＜0．01）．TherewasasignificantpositivecorrelationbetweenthesubcellularlocalizationofP21andthetumordifferentiation，metastasis，andthelocalizationofP21incytoplasmwasnoobviousassociatedwithageorHBVin-fection．Conclusion

P21changesitssubcellularlocalizationintheprocessoftransformationfromcirrhosistotumor，namelythe

shiftfromthenucleustothecytoplasm．Higherthedegreeofmalignancyofthetumorcellsorearlierthetumormetastasisis，thehasnoassociationwiththeageofonsetoflargertheproportionofcytoplasmicshifthas．Andchangesofsubcellularlocalization，tumors，hepatitisBvirusinfectionandtumorsize．

【Keywords】P21；Subcellularlocalization；Nucleus；Cytoplasm；HCC；Cirrhosisoftheliver

（ThePracticalJournalofCancer，2013，28：593～595）

原发性肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，

HCC）是世界上第五大常见恶性肿瘤，在癌症相关死亡原因中排名第三。尽管外科手术及肝移植治疗取得了很大进展，但肝癌的预后仍不乐观。

基金项目：湖南省科技厅项目（编号：2012FJ3118）作者单位：414000湖南师范大学附属岳阳医院（易院附属协和医院（何生松）

玲，邱荣元，王

刘崇梅，冯喜华，万焱鑫，伍小琼）；430022华中科技大学同济医学松柏，

P21具有广泛的细胞周期抑制活性，理论上其与

肝癌的发生发展及预后密切相关，然而国内外对其预测价值意见很不一致。目前认识到P21具有不同的功能状态，比如抑制细胞增殖与促进细胞增殖，抑制细胞凋亡与促进细胞凋亡。而P21的功能状态与亚细胞定位密切相关。

［1-3］，本课题组前期研究中初步证实当P21定位

于细胞质，胞质型P21促进HepG2细胞增殖、促进细

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胞周期运行、增强其抗凋亡能力。作为前期项目的延

伸，本研究采用免疫组织化学的方法，检测原发性肝细并探讨胞肝癌组织中P21表达情况及其亚细胞定位，与临床病理参数的关系。11．1

材料与方法

的115例肝硬化基础上发生的肝癌病例资料及手术切除于病理科存档的石蜡包埋标本，其中包括同一病例癌旁组织、肝硬化组织。115例中，男性的肝癌组织、81例，女性34例；年龄16～71岁，平均年龄47岁，中位年龄48岁；肿瘤直径平均5．6cm（1．5～12cm）。

Steiner标准分级：Ⅰ-根据Edmondson-Ⅱ级48例（41．74%）Ⅲ-Ⅳ级67例（58．26%）。HBsAg阳性98

例（85．21%）。

一般资料

收集2007年2月至2012年9月岳阳市第二人民医院、华中科技大学同济医学院附属协和医院收治

表1

临床病理参数年龄

＞35岁≤35岁HBsAg+－肿瘤直径＞3cm≤3cm病理分级Ⅰ-Ⅱ级Ⅲ-Ⅳ级肿瘤转移+－

37437414271526

8（3/37）2（2/4）

P21阳性（n=41）

3011

P21阳性表达与HCC临床病理特征的关系

P21胞核阳性（n=10）

7（7/30）3（3/11）

＞0．05

29（29/37）

2（2/4）

＞0．05

8（8/37）2（2/4）

＜0．05

8（8/14）2（2/27）

＜0．05

3（3/15）7（7/26）

12（12/15）19（19/26）6（6/14）25（25/27）

＜0．05

29（29/37）

2（2/4）

＜0．05＞0．05

P值＞0．05

23（23/30）8（8/11）

＞0．05

P21胞质阳性（n=31）

P值＞0．05

1．2主要试剂

鼠抗P21WAF/

CIP1单克隆抗体卡方检验；单因素相关分析采用Pearson相关法。多

求Hc值，推断P组之间的两两比较采用秩和检验法，值范围。22．1

结果

P21在肝脏不同组织中的表达

肝硬化组织中P21阳性表达率为10．43%（12/

（NeoMarkers）；SP试剂盒、DAB显色剂（北京中杉公司）。1．3

方法

采用SP法，严格按照试剂盒操作说明进行P21免疫组化染色，采用柠檬酸高温高压法进行抗原修复，DBA显色，抗体稀释度为1：200，苏木精复染，脱水，透封片。以PBS和正常血清分别代替一抗与二抗作明，

阴性对照。阳性细胞计数标准如下：每个位点随机选取3个高倍镜视野，平均每高倍镜阳性细胞＜5%为“－”，5%～25%为“+”，26%～50%为“++”，＞50%为“+++”。P21WAF/CIP1阳性染色为胞质型或核型，淡黄色、棕黄色或棕褐色，呈颗粒状或团块状。1．4

统计学方法

所有数据均用SPSS13．0软件包作统计处理。各组阳性表达率差异的比较及与临床参数之间关系采用

115），原发性肝细胞肝癌组织中阳性率为35．65%

（41/115），癌旁组织为38．26%（44/115），肝癌与癌旁组织相比，差异无统计学意义（P＞0．05），肝癌与肝硬化组相比，差异有统计学意义（P＜0．01），癌旁与肝硬化组相比，差异有统计学意义（P＜0．01）。2．2

胞质型P21在肝脏不同组织中的表达

胞质型P21阳性率在癌旁组织中为6．82%（3/

44），在肝硬化组织中为8．33%（1/12），在原发性肝细胞肝癌组织中为75．61%（31/41）。肝癌与癌旁组织及肝硬化组相比，胞质型P21阳性表达率的差异均有统计学意义（P＜0．01）；而癌旁与肝硬化组相比，差异

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。

无统计学意义（P＞0．05）。

2．3胞质型P21与肝癌组织临床特征的相关性Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级的阳胞质型P21在肝癌组织中Ⅰ-92．59%（25/27），性率分别为42．89%（6/14），胞质P21的阳性表达与肿瘤细胞分化程度明显负相关（γ=

－0．42，P＜0．01），胞质型P21在肝癌组织中无转移及有转移的患者中阳性率分别为73．07%（12/15），80．00%（19/26），胞质P21与肿瘤转移正相关（γ=0．27，P＜0．05），HBSAg、而与年龄、肿瘤直径无关（P＞0．05）。见表1。3

讨论

的浸润和转移

［11］

目前关于P21的亚细胞定位与肝癌的关系，研究

而关于P21与肝癌关系的报道极不一致，在尚不多见，

P21的表达意义也未取得一致结论。肝癌组织中，

为达到上述研究目的，我们曾采用基因定点诱变

［1-3］

，的方法构建了核定位信号突变的P21真核表达

载体，转染HepG2细胞，观察转染的HepG2细胞周期

及凋亡率的改变，进一步了解P21亚细胞定位与其功能活性的关系。

我们通过观察肝硬化基础上发生的原发性肝细胞癌患者，其肝癌组织、癌旁组织、肝硬化组织中P21的表达情况，亚细胞定位分布，结果显示HCC与癌旁肝组织P21的表达无统计学意义，但通过亚细胞定位的HCC主要表达在细胞质，分析表明，其比例可达到75．61%，而癌旁肝组织胞质表达比例为6．82%。进一步根据肝癌组织的肿瘤细胞分化程度及肿瘤转移情况进行相关性分析，胞质P21的阳性表达与肿瘤细胞分化程度明显负相关，胞质型P21的阳性表达与肿瘤转移正相关。

本组研究表明，在肝硬化组织中，由于炎症和纤维

P21表达上调，化影响，但主要定位于细胞核，其表达率与炎症及纤维化程度密切相关。而在肝癌组织，

P21也可见表达上调，但主要定位于细胞质，而且胞质表达的比例与肿瘤分化程度、肿瘤转移密切相关。因

细胞质P21的高表达，可能有助于原发性肝癌的发此，

发展。虽然P21具有广泛的细胞周期抑制活性，但生、

既往以P21为靶点的抗肿瘤治疗，并没有取得令人鼓舞的临床效果，考虑可能与忽视了P21蛋白的功能状态与其亚细胞定位密切相关，因此，从亚细胞定位角度，调整P21的抗肿瘤治疗策略，也许是条可行的途径。

参考文献

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（下转第598页）

锋．核定位信号突变型P21对

HepG2．2．15细胞病毒复制的影响〔J〕．临床肝胆病杂

锋，等．P21真核表达载体的构建

P21是el-Deiry等于1993年发现的1种能够被

p53转录激活的基因，编码分子量为21kDa的蛋白，因此命名为P21

。P21具有众多蛋白质结合位点，其中某些部位相互重叠，如P21可与细胞周期素（cyc-lin）、细胞周期素依赖的蛋白酶（CDK）、增殖细胞核抗

MAPK家族分原（PCNA）、切冬酶原3（Procaspase3）、子、钙调蛋白等相互作用，此外还有核定位信号（nu-NLS）、clearlocationalsignal，核输出信号（nuclearex-［5］

portsignal，NES），从而影响其亚细胞定位。

P21蛋白最初因其细胞周期抑制活性而为人们所

［4］

熟知，因而人们将其归属为抑癌基因的范畴。目前关

于P21功能的研究，认识到P21涉及到细胞的生长、分P21具有不同的功能状态，化、凋亡、老化。并且，比如抑制细胞增殖与促进细胞增殖，抑制细胞凋亡与促进

［6-7］

。而P21的功能状态与某些位点的磷酸细胞凋亡

［8］

亚细胞定位密切相关。化、

P21的抑癌功能与其核定位密切相关，而胞核P21的促进细胞生长及抗凋亡能力在许多细胞的研究

［9］

中得到证实，如在急性单核细胞性白血病、人乳腺癌

［10］

［11］

、神经肿瘤性疾患。当P21定位于细胞质，可与细胞凋亡信号分子相

结合，如与Procaspase3结合，阻止Fas介导的凋亡途［12-13］

，径并且通过抑制促凋亡激酶（apoptosissignal-regulatingkinase1，Ask1）而使抗凋亡效应进一步放［14］［15］大。Tanaka等发现，胞质P21蛋白可与Ｒho激酶形成复合体并抑制其激酶活性，导致肌动蛋白应力纤维丢失，促进细胞外生性生长。在某些肿瘤性疾患中，也发现胞核P21蛋白表达与肿瘤浸润和转移的相关性，其机制可能为胞核P21抑制Ｒho激酶活性，肌动蛋白应力纤维丢失，细胞活动性增强，最终导致肿瘤

．世界华人消化杂志，及其对HepG2细胞增殖影响〔J〕

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HPVDNA阳性患者的基因亚型进行分析，我们可见单一基因型HPV感染患者620例（77．7%），多重基因型

HPV感染患者178例（22．3%），后者的比例显著低于

［5-6］

，其他文献报道这可能是由于地域差别所致。最

后，我们对每种基因亚型HPVDNA阳性率进行分析，

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（收稿日期2013－06－07

修回日期2013－07－02）

（编辑：甘

艳）

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结果可见除HPV43型以外，其余20种亚型均被检测出，且HPV16型阳性率在50%以上，其余依次为HPV52型、HPV58型、HPV18型、HPV33型等，上述基因亚型均为高危型，其原因与本研究的HPVDNA阳性率显著高于流行病学调查一致，与研究对象的特点

［7-8］。有关

由于本院妇科的女性患者来自全省各地，因此本

研究结果可以在一定程度上反映本地区的情况。综上所述，本地区HPV感染患者以单一基因型感染最为常

HPV52型、HPV58型见，主要高危型包括HPV16型、等。

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修回日期2013－04－24）

（编辑：甘

艳）