抗bFGF人源性抗体的瞬时表达_纯化及鉴定

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2010.10.003

抗bFGF人源性抗体的瞬时表达、纯化及鉴定①

陶　俊　李　丹　邓　宁　王　宏　龚义平　向军俭(暨南大学生命科学技术学院抗体工程中心,广州510632)

　　中国图书分类号　R392.11　　文献标识码　A　　文章编号　1000-484X(2010)10-0876-05

[摘　要]　目的:将一株人源性中和性抗bFGF单链抗体基因转入真核表达载体,进行真核瞬时表达,通过细胞试验进一步验证其中和活性。方法:将1AscFv抗体基因克隆到真核表达载体pIgG中(编码全长人源性IgG1类抗体),T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑取4个克隆,经测序其中有一株含有正确的scFv序列,命名为pIgG-1A2,将pIgG-1A2转染真核细胞HEK293T进行瞬时表达,表达产物经蛋白G纯化后,SDS-PAGE检测纯化抗体的纯度;ELISA和Westernblot检测抗体的特异性;MTT法检测纯化抗体对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和人神经胶质瘤细胞株U87MG增殖的影响。结果:经酶切鉴定和测序发现pIgG-1A2含有正确的抗体轻重链基因,经293T细胞瞬时表达,表达产物经蛋白G亲和层析柱纯化后经SDS-PAGE鉴定,获得纯度为95%的电泳纯抗体,产量可以达到每升细胞培养上清10mg,交叉反应显示表达的抗体特异性针对bFGF,体外实验证实1A2能够抑制bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞的增殖,同时还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖。结论:通过真核细胞成功地表达了抗bFGF人源性抗体,纯化后获得了高纯度的抗体,对HUVEC和神经胶质瘤细胞株U87MG具有抑制作用,为抗bFGF人源性抗体抗肿瘤研究奠定基础。

[关键词]　bFGF;人源性抗体;瞬时表达;中和活性

Expression,purificationandcharacterizationofahumanizedantibodytobFGFbyHEK293Tcell

TAOJun,LIDan,DENGNing,WANGHong,GONGYi-Ping,XIANGJun-Jian.LabofMolecularImmunologyandAnti-bodyEngineering,LifeScienceandTechnologicalCollege,JinanUniversity,Guangzhou510632,China

[Abstract]　Objective:ToconstructandexpressanaturalizingscFv(1A)againstbFGFandidentifyitsneutralizingactivitybyinvitrocellexperiment.Methods:1AscFvwasclonedintoaeukaryoticexpressionvectorpIgGcontainingthegenomicsequencesofhumanIgG1con-stantregion,afterligatedbyT4DNALigase,theplasmidwastransformedintoE.coliDH5αstrains,andthenweselectedfourcloneforDNAse-quencing.AfterconfirmedbyDNAsequencing,wefoundthatonecloneincludedtherightscFvDNAsequence,therightclonewasnamedpIGG-1A2.ThentheplasmidsweretransfectedinHEK293TcellsbyFuGeneHD.ThesecretedantibodywasidentifiedbyELISA,andwaspu-rifiedbyproteinGaffinitychromatography.ThepurityoftheantibodywasanalyzedbySDS-PAGE,andthespecificityoftheantibodywasas-sessedbyELISAandWesternblot.Theanti-tumorandanti-vascularendothelialcelleffectsoftheantibodyongliomacellsandhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)wereanalyzedbyMTTassay.Results:Theeukaryoticexpressionvectorforhumananti-bFGFantibodywasconstructedcorrectly.Afterexpressedby293Tcells,theantibodycouldbindwithbFGFspecifically.AfterpurifiedbyproteinGaffinitychro-matography,thepurityoftheantibodywasassessedbySDS-PAGEandfoundtobe>95%pure,andwecanobtain10mgpurifiedantibodyfrom1literofcellculturemedium.Theinvitroexperimentresultsshowedthat1A2wasabletoinhibittheproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcellsinducedbybFGFandtoihhibittheproliferationofgliomacells.Conclusion:Theeukaryoticexpressionvectorforhumananti-bFGFantibodygeneissuccessfullyconstructedandexpressedtransientlyin293Tcells.Expressedantibodycouldinhibittheproliferationofhu-manumbilicalveinendothelialcellsinducedbybFGFandinhibittheproliferationofgliomacells.ItmaythereforepresentanewtherapeuticcandidateforthetreatmentofcancersthataredependentonbFGFsignalingforgrowthandsurvival.

[Keywords]　bFGF;Humanantibody;Transientexpression;Neutralizingactivity

①本文为国家科技计划“863”专题课题(2009AA02Z112)

作者简介:陶　俊(1981年-),男,在读博士,主要从事基因工程抗

体研制方面的研究,E-mail:taojun811004@sina.com;

通讯作者及指导教师:向军俭(1952年-),男,教授,博士生导师,主

要从事抗体技术与应用方面的研究,E-mail:txjj@jnu.edu.cn。

　　bFGF与肿瘤的血管新生和生长有关,用抗体阻断bFGF的活性被认为是一种治疗肿瘤的有效方法。已有多株抗bFGF抗体体内外抑制肿瘤试验的

报道。在多种动物体内,一株中和活性的单抗(GD2)能抑制bFGF或肿瘤组织诱导的血管新

陶　俊等　抗bFGF人源性抗体的瞬时表达、纯化及鉴定　第10期·877·

生[1,2]。另一株单抗,3H3,能抑制黑色素瘤细胞的增殖[3]。Aonuma等[4]制备了两株中和活性单抗,2G11和1E6,前者识别的是bFGF的肝素结合位点,后者识别的是bFGF与受体结合的位点,体内实验证实1E6能抑制肿瘤生长,而2G11不具备抗瘤作用。国内,谢庆祥等[5]和林卫等[6]在裸鼠体内能够抑制膀胱癌和卵巢癌的生长和血管生成,并呈浓度依赖性,提示bFGF单抗有望成为膀胱癌和卵巢癌生物治疗的新方法。向军俭等[7]制备了19株抗bFGF单抗,通过体外实验证实,其中一株抗体能够诱导B16细胞凋亡,近期的体内试验发现此株抗体能够明显抑制黑色素瘤的生长和转移。

这些报道证实在多种试验条件下,抗bFGF抗体能阻断血管新生和抑制肿瘤生长。但这些抗体都是动物来源的抗体,用于人类疾病的治疗存在半衰期短、血清病发生率高、易在人体内产生抗体导致不能重复使用等弊端。制备全人源性的bFGF抗体,是克服上述弊端的有效方法。目前国外还未见关于bFGF人源性抗体或人源化抗体的报道。而国内关于bFGF人源性或人源化抗体的报道也较少。向军俭等[8]将一株中和性的鼠源性抗体的可变区基因与人抗体的恒定区基因进行重组之后,成功地表达了抗bFGF嵌和抗体,但并未见后续关于此抗体生物学活性的报道。本实验室前期已有从人自身免疫库中筛选人源性抗FGFFab抗体的报道,但后续的研究发现这几株人源性抗体在体外没有中和bFGF的活性,因此我室又与北京海军总院中心实验室合作筛选得到了七株人源性抗bFGF单链抗体,经初步验证其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体的结合。

本实验将我室前期筛选到的一株人源性中和性抗bFGF单链抗体基因转入真核表达载体,可编码全长的IgG1亚类的人源性抗体,通过亲和层析后,进一步研究其生物学活性。

[9,10]

公司产品,转染试剂FugeneHD为美国罗氏公司产品,所有抗体产品均为德国Sigma公司产品,CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品,丙戊酸、氯喹等化学试剂购自于Sigma公司,293T细胞无血清培养基293SFMIImedium购自于Invitrogen公司,PCR引物合成及DNA序列测定由上海生工完成。HEK293T细胞,神经胶质瘤细胞株U87MG为本室保存,原代人脐静脉细胞血管内皮细胞(HUVEC)由中山大学中山医学院生物化学教研室高国权教授惠赠,HUVEC培养于M199培养基中,同时加入2%的LowSerumGrowthSupplement(LSGS),10%的FBS。引物L1,5′-AAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAGGCTGAGCTGATGCA-3′;引物L2,5′-TGGGCTGACTTAGGACGGTCAGCTT-3′;引物L3,5′-TGCT-GTGGTATTCGGCGGAGGGACCA-3′;引物L4,5′-TCTA-GAATTATGAACATTCT-3′;引物H1,5′-GAGCTCACTC-CCAGGTGCAGCTGTTGGA-3′;引物H2,5′-GGGCC-CTTGGTGGAGGCTGAGGAGACAGTGA-3′。1.2　方法

1.2.1　PCR扩增抗体的轻链可变区(VL)和λ链恒定区　分别以scFv和pCcomb3Xλ为模板,在50μl反应体系中按常规PCR扩增VL基因和λ链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化回收。1.2.2　VL和λ链恒定区的组装　将回收的VL基因和λ链恒定区基因加入到25mlPCR反应体系中,经过7个循环重叠后,加入λ链上下游引物,扩增出全长的λ链基因,PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化回收后,按PMD-18Tsimple试剂盒说明书克隆到PMD-18T载体上,成为PMD-18T-Vλ,送上海生工测序。1.2.3　PCR扩增抗体重链可变区(VH)　以scFv为模板,在50μl反应体系中按常规PCR扩增VH基因。PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化回收后,按PMD-18Tsimple试剂盒说明书克隆到PMD-18T载体上,成为PMD-18T-VH,送上海生工测序。

1.2.4　全人源性抗体基因表达载体的构建　分别用XbaⅠ/HindⅢ和SacⅠ/ApaⅠ双酶消化,将λ链和VH从pMD-18T-Vλ和pMD-18T-VH载体上切下,克隆到pIGG载体上,转化大肠杆菌DH5α,挑取4个克隆进行酶切鉴定和测序。1.2.5　人源性bFGF抗体的瞬时表达　接种107个293T细胞到75cm2细胞培养皿中,以含10%FBS的DMEM培养基37℃培养36小时,转染前将细胞培养基换为含有2%FBS,25μmol/L氯喹的DMEM培养基。取构建好的pIGG-1A2质粒20μg,加入到1mlOpti-MEMⅠ培养基中,混匀后加入80μl的转染试剂1　材料与方法

1.1　材料　利用噬菌体抗体库筛选到的全人源性bFGFscFv基因的质粒Pcom3X-1A为我实验室保存。噬菌体展示载体pCcomb3Xλ,真核表达载体pIGG由

美国Scripps研究所的C.F.BarbasIII惠赠,该载体包含IgG1重链恒定区CH1-CH3以及部分恒定区内含子。rTaq酶、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DL3000DNAmarker为大连宝生物产品、DNA快速纯化/回收试剂盒及质粒提取试剂盒为杭州爱思进公司产品,去内毒素质粒抽提试剂盒为美国OMEGA·878·中国免疫学杂志2010年第26卷

FugeneHD,涡旋混匀后,室温静置15分钟,然后逐滴加入到细胞培养皿中,混匀后37℃培养6小时,0.015mol/LPBS洗涤细胞两次后,加入含有4mmol/L丙戊酸的293SFMIImedium,33℃培养,每两天换液一次,共换液三次。将换掉的细胞培养上清收集起来用于纯化抗体。

1.2.6　夹心ELISA检测细胞培养上清中抗体的表达　以10mg/L羊抗人Fab多抗包被酶标板,加细胞培养上清反应后,再加羊抗人IgGFc片段-AP标记的抗体孵育,加入底物PNPP显色,测A405值,实验以293T细胞上清为阴性对照。1.2.7　间接ELISA检测细胞培养上清中抗体与bFGF的结合　分别以1mg/L的bFGF,aFGF,VEGF包被酶标板,加细胞培养上清反应后,再加羊抗人IgGFc片段-AP标记的抗体孵育,显色,测A405值,实验以293T细胞上清为阴性对照。

1.2.8　蛋白G纯化抗体　将收集好的细胞培养上清经0.22μm滤膜过滤后,上蛋白G纯化柱,洗脱后经超滤管超滤,最后经Wensternblot和BCA法测定抗体纯度和浓度。

1.2.9　HUVEC增殖抑制试验　以2×103/孔的细胞密度接种原代HUVEC细胞到96孔板中,37℃培养16小时后,将培养基换为含0.5%FBS,1%LowSerumGrowthSupplement(LSGS)的M199培养基,同时加入不同浓度的抗bFGF人源性抗体,对照组加入相同浓度的人IgG,37℃培养4天后,利用CCK-8试剂盒测定活细胞数量。

1.2.10　肿瘤细胞增殖抑制试验　将神经胶质瘤株U87MG进行消化,DMEM培养基重悬细胞,调整细胞密度为104ml-1。在96孔板中,每孔加入100μl细胞,37℃培养过夜,使细胞贴壁。加入不同浓度的人源性抗体和对照抗体,37℃培养4天。4天后加入10μlCCK-8,继续孵育3小时。酶标仪测定OD450值。

出的轻链序列正确。重链可变区通过引物5和6扩增(见图2A),经测序确定扩增出的重链可变区序列正确。

2.2　含轻重链基因双顺反子表达载体的构建　轻

链全长基因和重链可变区(VH)基因经测序正确后,VH通过SacⅠ/ApaⅠ双酶切,λ链通过XbaⅠ/HindⅢ双酶切,然后分别连入通过相应酶切消化之后的pIgG载体中。由于从美国得到此载体时,其上已经插入了一株人源性抗体的轻重链基因,通过与我们的抗体基因进行序列比较,发现我们VH的基因含有EcoRⅤ酶切位点,而载体上的重链基因没有此位点,我们的轻链基因没有XhoⅠ酶切位点,而载体上的轻链基因含有此位点,因此可以通过EcoRⅤ+XhoⅠ双酶切鉴定我们的抗体基因是否被插入。因为载体上还含有另一XhoⅠ酶切位点,因此如果载

图1　重组抗体的真核表达载体(pIgG)

Fig.1　Expressionvector(pIgG)ofrecombinantantibody

2　结果

2.1　抗bFGF人源性抗体λ链和VH基因的扩增及

鉴定　由于我们前期筛选到的一株人源性中和性抗bFGF单抗为scFv形式,而我们使用的真核表达载体为pIgG(见图1)此载体含有人IgG1抗体的重链恒定区和能使抗体分泌表达的信号肽,可分泌表达全长的人源性抗体,但scFv在插入此表达载体前,需在轻链可变区后面连上恒定区,因此我们先通过引物1和引物2扩增出轻链的可变区,利用引物3和4扩增出轻链的恒定区(见图2A),然后通过重叠PCR扩增出全长的轻链(见图2B)。通过测序,确定扩增图2　抗bFGF人源性抗体λ链和VH基因的PCR扩增Fig.2　AmplificationofλchaingeneandVHgenebyPCR

Note:A.Lane1.VHgene;Lane2.VLgene;Lane3.Theconstantregiongene

ofλlightchain(CLgene);M.Marker3000;B.Lane1.λlightchaingene;M.Marker3000.

陶　俊等　抗bFGF人源性抗体的瞬时表达、纯化及鉴定　第10期·879·

体中插入了抗bFGF抗体的轻重链基因,则通过EcoRⅤ+XhoⅠ双酶切应该切出1100bp左右的片段,而没有插入抗bFGF抗体的轻重链基因则通过EcoRⅤ+XhoⅠ双酶切应该切出900bp左右的片段,经酶切鉴定有两个克隆中插入了抗bFGF抗体的轻重链基因(见图3),我们将这两个载体分别命名为pIgG-1A1,pIgG-1A2,经测序发现pIgG-1A1有移码突变,而pIgG-1A2含有正确的抗体基因序列,因此挑选pIgG-1A2进行真核瞬时表达。

2.3　HEK293T细胞的转染和抗体的表达　我们利用罗氏公司的阳离子脂质体转染试剂FugeneHD转染HEK293T细胞,根据前期的预实验我们确定转染时FugeneHD与pIgG载体的比例为8/2,即每转染2μg质粒加入8μlFugeneHD,经过33℃的低温诱导表达,我们测得细胞培养上清中抗体的表达量为10μg/ml,经过6天培养,我们共收集到200ml培养上

清。经过蛋白G纯化后得到1.8mg抗体。SDS-PAGE显示纯化后的抗体纯度达到95%(见图4)。2.4　纯化后抗体的ELISA和Westernblot检测　纯化后的抗体进行间接ELISA(表1)和Westernblot(图

5)检测其结合bFGF的活性及与其他生长因子的交叉反应,结果显示纯化后的抗体1A2能够结合bFGF,而与FGF-1及VEGF不发生交叉反应。2.5　抗bFGF人源性抗体抑制血管内皮细胞增殖　加入纯化后的IgG-1A2能抑制bFGF诱导的HU-VEC细胞的增殖,抑制的效果随抗体浓度的增加而增强(见图6)。2.6　人源性抗体抑制神经胶质瘤细胞增殖　神经胶质瘤细胞是一类高度依赖于bFGF的肿瘤,它们能够自分泌bFGF。已有文献报道中和性鼠源性bFGF单抗能够抑制胶质瘤细胞株U87MG的生长,通过加入不同浓度的抗bFGF人源性抗体,发现能够抑制U87MG的增殖,并呈现剂量依赖性(见图7)。

表1　ELISA检测1A2的抗原结合特异性

Tab.1　Assaytheantigenbindingspecificityof1A2byELISA

Antibody1A2

PBSNote:1)P<0.01.

Coatingantigen

bFGF1.64±0.12

0.12±0.02

1)

aFGF

0.12±0.020.13±0.02VEGF

0.24±0.040.14±0.02

图3　含轻重链基因双顺反子表达载体的构建及鉴定Fig.3　Restrictionenzymedigestionanalysisoftheexpression

vectorpIgG-1A1andpIgG-1A2

Note:Lane1.pIgG-1A1digestionbyEcoRⅤ+XhoⅠ;Lane2.pIgG-1A2diges-tionbyEcoRⅤ+XhoⅠ;Lane3.pIgGdigestionbyEcoRⅤ+XhoⅠ.

图5　Westernblot检测1A2的抗原结合特异性

Fig.5　Assaytheantigenbindingspecificityof1A2byWestern

blot

Note:Lane1.bFGF;Lane2.aFGF;Lane3.VEGF.

图4　抗体经蛋白G纯化后的SDS-PAGE图

Fig.4　SDS-PAGEanalysisofantibodypurifiedbyproteinG

Note:Lane1.Marker;Lane2.1A1;Lane3.1A2;Lane4.Nativecontrol.

图6　1A2对bFGF诱导的HUVEC细胞促增殖作用的影响Fig.6　InhibitionofbFGF-inducedproliferationby1A2·880·中国免疫学杂志2010年第26卷

但限制哺乳动物细胞表达系统应用的重要原因之一是其产量低。因此基因工程抗体在哺乳动物细胞中的高效表达尤为重要。

本研究选择了HEK293T细胞进行瞬时表达,通过优化转染条件,降低培养温度,同时加入组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丙戊酸,使抗体的表达量达到了10μg/ml,经过纯化后基本能够满足体外实验的需求。从而为进一步研究中和性抗bFGF人源性抗体的作用打下了坚实的基础。

图7　1A2对U87MG细胞增殖的抑制Fig.7　Inhibitionoftumorcellgrowthby1A2

4　参考文献

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3　讨论

本研究将我室前期筛选到的一株中和性人源性bFGFscFV抗体基因扩增后克隆到真核表达载体pIgG中,将其转化为全长的人IgG1形式进行真核分泌表达,表达的抗体经过亲和层析纯化之后,通过体外实验证实中和性bFGF人源性抗体1A2能够明显抑制bFGF对HUVEC细胞的促增殖作用,并且还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖。

bFGF与肿瘤的血管新生和生长有关,用抗体阻断FGF的活性被认为是一种治疗肿瘤的有效方法。已有报道有多株中和性鼠源性抗bFGF单抗能在体内外抑制肿瘤的生长[11]。本室前期已获得三株中和性鼠源性单抗,体外实验证实这三株单抗能够抑制bFGF对HUVEC细胞的促增殖作用,同时还能抑制黑色素瘤细胞(B16)、神经胶质瘤细胞(U87MG)、肝癌细胞(HepG2)等细胞的增殖,并与化疗药物顺铂具有协同作用。体内实验证实其中一株单抗能有效抑制黑色素瘤的生长和转移(结果待发表)。但由于鼠源性mAb会引起人抗鼠抗体(HAMA)反应,从而限制其在临床中的应用。因此筛选人源性中和性抗bFGF抗体将具有很好的应用前景。我室前期筛选得到了7株抗bFGF人源性抗体,通过竞争ELISA发现其中一株单抗能够抑制bFGF与FGFR1的结合,因此本实验对此株抗体进行了真核表达,并进一步验证其生物学活性。

对于表达完整的且具有活性的人源化抗体来说,哺乳动物细胞表达系统因其在蛋白质的折叠、糖基化等翻译后加工方面不可替代的优点成为理想的选择,而且所表达的抗体稳定性好、免疫原性低[13]。

[12]

[收稿2010-03-21　修回2010-07-02]

(编辑　张晓舟)