常规病毒学实验技术

常规病毒学实验技术（⼀）病毒的培养

实验动物：家兔、⼩⽩⿏、⼤⽩⿏、豚⿏、仓⿏主要⽤于：

①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗

③测定各毒株之间的抗原关系，（⽤实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫⾎清和单克隆抗体

⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒⼒测定、建⽴病毒病动物模型等

注意：选择对⽬的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。鸡胚

（⼀）条件要求

SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。（⼆）优点

组织分化程度低，可选择不同的⽇龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有⼤量病毒，容易采集和处理，⽽且来源充⾜，设备和操作简便易⾏。（三）接种途径

1．绒⽑尿囊膜接种（10-12⽇龄鸡胚）主要⽤于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。1）⽅法⼀（造⼈⼯⽓室）

①在胚胎附近近⽓室处，选择⾎管较少的部位，⽤电烙器在卵壳上烙⼀个直径约3-4mm的烤焦圈。

②⽤碘酊和酒精消毒后，⼩⼼⽤⼑尖撬起卵壳，造成卵窗。③在⽓室端中央钻⼀个⼩孔。

④⽤针尖挑破卵窗中⼼的壳膜，切勿损伤其下的绒⽑尿囊膜。

⑤滴加滴⽣理盐⽔于刺破处，⽤橡⽪乳头紧贴于⽓室中央⼩孔上吸⽓，造成⽓室内负压，使卵窗部位的绒⽑尿囊膜下陷⽽形成⼈⼯⽓室，此时可见滴于壳膜上的⽣理盐⽔迅速渗⼊。⑥⽤1ml注射器滴⼊2-3滴接种物于绒⽑尿囊膜上。

⑦⽤透明胶纸封住卵窗，或⽤玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的⽯蜡密封，⽓室中央的⼩孔⽤⽯蜡密封。

⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。2）⽅法⼆

①在⽓室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的⼝。②⽤灭菌眼科镊⼦撕去⼀⼩⽚内壳膜。

③滴⼊接种物。④⽤透明胶纸封闭开⼝。2．尿囊腔接种（10-11⽇龄）⽤于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出⽓室和胚位

2）在⽓室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）⽤钢锥穿⼀⼩孔

4）将注射器针头沿此⼩孔插⼊0.5-1cm，注⼊接种物5）⽤⽯蜡封⼝，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8⽇龄）

主要⽤⾍媒病毒以及鹦鹉热⾐原体和⽴克次⽒体等的分离和增殖。1）画出⽓室和胚位

2）垂直放置在卵座上，⽤碘酊和酒精消毒⽓室外端3）以钢锥在⽓室中央锥⼀⼩孔

4）将注射器针头沿此⼩孔插⼊3cm，注⼊接种物5）⽤⽯蜡封⼝，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次4．其它接种途径

⽺膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒静脉接种，蓝⾆病毒脑内接种，狂⽝病毒组织培养

原代细胞：应⽤胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加⼊营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并⽣长增殖。

继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。

传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作⽤下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很⾼的增殖势能，⽽且⼏乎可以⽆限地传代。

原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）

1）在⽆菌条件下采取9-10⽇龄鸡胚，置灭菌平⽫中，除去头（或仅除去喙和眼）、⽖和内脏，并剪成块。2）⽤Hanks液，充分冲洗后移⼊⼤号青霉素瓶或其它⼴⼝瓶中，⽤眼科剪剪成1mm3⼤⼩的碎块。3）加⼊Hanks液，充分冲洗，并静置⼏分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。如此反复冲洗2-3遍。

4）于沉淀组织块内加⼊约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH⾄7.6-7.8，振荡混匀后置37℃⽔浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动⼀次。

5）取出，⼩⼼吸弃上层胰酶溶液，⽤洗液轻洗2次后，⽤⼤⼝径吸管反复吹打，使细胞游离。

6）⽤双层或三层纱布过滤，收集滤液于离⼼管中，以600rpm离⼼沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加⼊营养液，并⽤吸管反复吹打，直⾄形成均匀的细胞悬液。7）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml）

取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫——构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10分钟，充分振荡后进⾏计数。按⽩细胞计数法计算4⾓4个⼤⽅格内的细胞总数（N）。每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。传代细胞系培养

优点：1)可以⽆限的传代。2)不少细胞系对病毒很敏感。

3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的⼤量⽣产。4)⽣长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：在传代过程中遭到⽀原体和病毒的污染。细胞分散剂

1．胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发⽣⽔解，导致细胞间质⽔解⽽使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2．⼄⼆胺四⼄酸⼆钠（EDTA）营养液

1．⼈⼯综合营养液

氨基酸、糖类、⽆机盐类、维⽣素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助⽣长因⼦。2．⾎清

1）动物⾎清中含有细胞⽣长所必须的各种营养因⼦。2）促进细胞的贴壁和⽣长。3）具有很强的酸碱缓冲作⽤。（⼆）病毒感染⼒的滴定LD50，EID50，TCID50（TCID50的测定）

1．在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1—10-10。

2．将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每⼀稀释度作8孔，每孔接种100ul。3．然后在每孔加⼊细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。

4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。5．逐⽇观察并纪录结果，⼀般需要观察5-7天。

6．结果的计算，按Reed-Muench两⽒法或Karber法进⾏。TCID50的计算⽅法：

⾼于50%的百分数-50% 91.6-50

距离⽐例= = =0.8

⾼于50%的百分数-低于50%的百分数 91.6-40

lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+⾼于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.82. Karber法

病毒液稀释度出现CPE孔的⽐率10-1 8/8=110-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.12510-6 0/8=0

lgTCID50=L-d(s-0.5)L: 最⾼稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔⽐率总和

lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)=-3.875

TCID50=10-3.875/0.1ml（三）病毒中和试验⼀、原理

抗体与相应的病毒粒⼦特异性地结合，使后者丧失感染能⼒。⼆、⽤途1. 疾病诊断。2. 病毒分离株的鉴定。

3. 不同病毒株的抗原关系研究。4. 疫苗免疫原性的评价。5. 免疫⾎清的质量评价。

6. 测定实验动物⾎清中是否存在抗体等。三、分类

（⼀）终点法中和试验1. 固定病毒——稀释⾎清法。

1) 将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。

2) 在96孔微量培养板中将⾎清作连续倍⽐稀释（具体⽅法是在96孔板中先加⼊50ul⽣

长液，再加50ul待检⾎清，混匀后，吸50ul⾄下⼀孔，如此下去。⼀直到1:256），每个稀释度作4孔。3) 在上述各孔内加⼊50ul稀释好的病毒液，混匀后放⼊37℃5%CO2培养箱中作⽤45min-60min。

4) 同时设待检⾎清毒性对照，阴、阳性⾎清对照，病毒对照和正常细胞对照。

5) 感作完成后每孔加⼊100ul细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐⽇观察并记录结果。

6) 结果计算，按Reed-Muench两⽒法或Karber法进⾏。Reed-Muench计算⽅法：⾎清稀释度CPE孔数⽆CPE孔数累计

CPE孔数⽆CPE孔数保护率（%）1:4（10-0.6）0 4 0 9 1001:16（10-1.2） 1 3 1 5 831:64（10-1.8） 2 2 3 2 401:256（10-2.4） 4 0 7 0 01:1024（10-3.0） 4 0 11 0 0⾼于50%的保护率-50%距离⽐例=

⾼于50%的保护率—低于50%的保护率83-50= = 0.783-40

⾼于50%的保护率⾎清稀释度的对数+距离⽐例×稀释系数的对数=-1.2+0.77×(-0.6)=-1.66

-1.66的反对数=1/46

即：1:46稀释的待检⾎清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。2. 固定⾎清——稀释病毒法。1) 将病毒作连续10倍稀释

1）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种⼀纵排共8孔，每孔50µl，做两块板⼦，在⼀块板⼦的每孔加⼊50µl待检⾎清（试验组），另⼀块板⼦的每孔加⼊50µl正常⾎清（对照组），混合后置37℃ 5%CO2培养箱作⽤1h。2）然后在每孔中加⼊100µl细胞。3）另外还设两纵排正常细胞对照。

4）置37℃ 5%CO2培养箱培养，逐⽇观察并记录结果。5）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算⾎清的中和指数。试验组TCID50

中和指数=对照组TCID50

(⼆) 蚀斑（痘斑）减数试验1、蚀斑技术

病毒蚀斑：⼜称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。

原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。⽤途：①⽤于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。2、蚀斑减数试验

将病毒——正常⾎清混合物以及病毒——待检⾎清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进⾏蚀斑测定，⽐较病毒——正常⾎清组和病毒——待检⾎清组产⽣的蚀斑数，两者的差数表⽰待检⾎清的中和能⼒。以试验组的蚀斑数⽐对照组减少50%作为判定依据，⾎清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。(三) 交叉保护试验

先将实验动物进⾏主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进⾏攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要⼤量的实验动物。⽤途：（1）应⽤已知V鉴定未知V（2）应⽤已知免疫⾎清鉴定未知V（3）应⽤已知V鉴定未知⾎清（四）病毒的分离和鉴定病毒材料的注备

1．脑、肝、肌⾁等器官或组织

充分研磨后加⼊5倍量的Hank’s液（内含P.S各200V/ml）反复冻融三次。2000rpm 10min，取上清作接种物。2．⿐液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物

⽤内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，200rpm 10min取上清作接种物。3．咽喉拭⼦或⿐拭⼦

仔细⽤棉拭⼦擦拭咽喉部，并迅速将其泡⼊盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）试管内，充分涮洗棉拭⼦，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000rpm 10min，收集上清作接种物。4．粪便

⽤含100u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀释，4℃感作4h，2000rpm 10min取上清作接种物。5．⽆菌的体液或鸡胚液直接接种⽤。接种⽅法1．实验动物2．鸡胚

⽬前常⽤鸡胚分离的病毒有正粘V、副粘V、痘V、脑炎V及引起禽类疫病的其它许多V。3．组织培养细胞。病毒增殖的判定1．细胞病变（CPE）2．抗原的测定

3．中和试验4．病毒间的⼲扰现象⼄型脑炎V 脊髓灰质炎V流感V 西⽅马脑炎V

猪传染胃肠炎⽜病毒性膜炎粘膜病V5．电⼦显微镜观察6．实验动物或鸡胚接种病毒感染⼒的滴定LD50、EID50、TCID50病毒理化学特性的测定

1．病毒核酸型鉴定（药物抑制试验）FUDR、IVDR、BRUDR

原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物，进⼊cell后发⽣磷酸化，掺⼊新合成的DNA 以代替胸腺嘧啶产⽣⾄功能分⼦，从⽽抑制DNA的合成。常⽤浓度为50ug/ml。2．脂溶剂敏感性试验1）⼄醚敏感试验

取同批病毒分装于两个青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加⼊⿇醉⽤⼄醚，使终浓度为20%，两瓶均⽤橡⽪塞塞紧后，置4℃冻箱内作⽤24h，其间不时振荡，随后以2000rpm 离⼼20min。已加⼄醚的⼩瓶，⽤⽑细吸管吸取病毒液，移⼊另⼀⼩瓶内，适当吹打，使残余⼄醚挥发殆尽，然后滴定两组病毒的TCID50。2）氯仿敏感性试验

向病毒液内加⼊分析纯氯仿，使其终浓度为4.8%，置4℃振荡混合10min。随后500rpm 5min，然后吸取上层液体，滴定病毒TCID50。对照组病毒加⼊终浓度为4.8%的⽣理盐⽔，同样处理和滴定。3．胰蛋⽩酶敏感试验

脊髓灰质炎V、猪传染性胃肠炎V对胰酶有较强的抵抗⼒，痘V、呼肠孤V、疱疹V易被胰酶灭活。取病毒液两瓶，每瓶1ml,在其中1瓶加⼊1ml 1%的trypsin，使终浓度为0.5%，另⼀瓶加⼊1ml 1640（培养基），⽤橡⽪塞塞紧瓶⼝，将⼩瓶倒转⼏次，使其充分混合，置37℃1h，随即加⼊灭活犊⽜⾎清8ml，充分混合，终⽌胰酶的作⽤。最后滴定两瓶V的TCID50。4．耐酸性试验

pH3.0 2h or pH5.0 1h

取等量病毒液两瓶，⽤0.1mol/L HCL将1个⼩瓶中的病毒液的pH调⾄3.0(or 5.0)，并在另⼀个⼩瓶内加⼊相同于⽤酸量的培养基作为对照，置37℃⽔溶或室温中感作2h(or 1h)，再⽤5.6%NaHCO3溶液将pH调回⾄7.2左右，对照组再加紧⼊相同于NaHCO3量的培养基，测定两者的TCID50。5．耐热性试验

将病毒液分成等量的11⼩瓶，其中4⼩瓶分别置50℃、60℃、70℃、80℃⽔溶中1h，另6瓶置50℃⽔浴中分别感作5、10、15、30、60和180min，随后测定每瓶V的感染X。6．病毒粒⼦⼤⼩测定1)电⼦显微镜直接观察（透射电镜、磷钨酸负染）2)超速离⼼沉淀3)滤过试验

取澄清的病毒液20ml，留出1ml作为对照，将剩余的19ml病毒液在正压下依次通过孔经为450nm、225nm、100nm和50nm的各级微孔，每通过⼀种孔径的滤膜就吸取1ml滤液⽤为样品，并将剩余的滤液通过⼀次滤膜。最后测定原病毒液以及各级滤液的TCID50。

病毒液种类 TCID50/0.1ml

滤前病毒液 10-6.75450nm孔径液 10-6.23225nm孔径液 10-5.78100nm孔径液 10-4.5050nm孔径液 10-0.50免疫——⾎清学检查

⽬的：①新分离毒株的种类及型别的鉴定。

②检测发病动物体液中的Ab，或进⼀步⽐较动物急性发病期和恢复期⾎清中的Ab效价，了解病毒性Ab是否有明显的增长，从⽽判定V感染的存在。（⼀）中和试验1．终点法中和试验

固定病毒——稀释⾎清法中和试验固定⾎清——稀释病毒法中和试验2．蚀斑（痘斑）减数试验1）蚀斑技术

病毒蚀斑，⼜称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。

原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑单位。⽤途：①⽤于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。2）蚀斑减数试验

将病毒——正常⾎清混合物以及病毒——待检⾎清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进⾏蚀斑测定，⽐较病毒——正常⾎清组和病毒——待检⾎清组产⽣的蚀斑数，两者的差数表⽰待检⾎清的中和能⼒。以试验组的蚀斑数⽐对照组减少50%作为判定依据，⾎清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。3．交叉保护试验

先将实验动物进⾏主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进⾏攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要⼤量的实验动物。⽤途：（1）应⽤已知V鉴定未知V；（2）应⽤已知免疫⾎清鉴定未知V；（3）应⽤已知V鉴定未知⾎清。（五）凝集试验定义：

颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）或表⾯载有抗原的颗粒状的物质（如聚苯⼄烯胶乳、红细胞、炭素颗粒等），与相应抗体在电解质存在下凝集成团的试验。分类

直接凝集试验：颗粒状Ag与相应Ab所发⽣的凝集反应。（布⽒杆菌）

间接凝集试验（被动凝集试验）：可溶性抗原吸附到载体颗粒表⾯，与相应抗体所发⽣的凝集反应，可以证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝集试验（反向被动凝集试验）：将抗体吸附到颗粒表⾯与相应抗原所发⽣的凝集反应。间接⾎凝试验胶乳凝集试验

炭凝集试验间接凝集试验皂⼟凝集试验脂质体凝集试验

间接凝集抑制试验：先将被检的抗体（或抗原）与已知的抗原（或抗体）作⽤后，再与抗体（或抗原）致敏的颗粒时⾏反应。反向凝集抑制试验

间接凝集试验的优点：快速、简便、特异、敏感间接⾎凝试验（IHA）（PHA）

⼝蹄疫、猪瘟、⼸形体、胸膜肺炎、⾐原体

反向IHA：FMDV、⽔疱病病毒Ag、猪传染笥胃肠炎病毒Ag、⼩鹅瘟病毒Ag等。红细胞作为载体的优点：1．来源⼴泛，容易取得。

2．红细胞表⾯⼏乎可以吸附任何⼀类的Ag或Ab，如蛋⽩质、糖蛋⽩、核蛋⽩以及多糖等。3．具有天然的均⼀性，⽐其它许多载体都更容易标准化和规格化。缺点：容易破裂、难于保存IHA的优点：

①敏感性⾼、特异性强、重复性和稳定性好，操作简便、反应迅速。②既可定性⼜可半定量，⽽且试剂价格低廉，不需要特殊、复杂的设备。

注意：影响红细胞凝集的因素很多：红细胞的来源，致敏条件、操作技术、标本中的杂质、细菌污染和类属Ag常引起⾮特异性凝集反应。

1．红细胞的选择和保存

选择：许多种类动物的红细胞，包括⼈的0型红细胞都可⽤，但⽤得最多的是绵⽺红细胞。保存：⽤玻璃珠脱纤法采集或⽤肝素抗凝。

②⽆菌的红细胞在4℃冰箱中可保存3-4天。

②采⾎时加等量⽒液和适量抗⽣素，4℃保存2周，但这样红细胞致敏时容液⾃凝。2．红细胞的醛化

醛化剂：甲醛、戊⼆醛、丙酮醛、丙酮醛—甲醛双固定、戊⼆醛—丙酮醛双固定。1）⽆菌采取绵⽺静脉⾎，加⾄红细胞保存液内，4℃保存备⽤。

2）取红细胞悬液1份，加⼊10倍量0.1mol/L、PH7.2磷酸缓冲液（PH7.2PB），洗5遍，并以该液配成8%红细腻悬液。3）红细胞悬液1份+3%丙酮醛液等量，24左右的室温中⽤电磁搅拌器缓慢搅拌17h。PH7.2PB 配成8%悬液，——丙酮醛固定红细胞悬液。

4）丙酮醛固定红细胞悬液1份+等量3%甲醛液，如上搅拌17hr。

5）再以PH7.2PB液洗5遍，最后⽤内含0.1%叠氮钠的ph7.2PB配成20%的红细胞悬液，分装后置4℃冰箱内保存，可⽤2个⽉—双醛化红细胞悬液。3．红细胞的鞣化

作⽤：可增加红细胞吸附蛋⽩质的能⼒，新鲜红细胞⽤1：200000浓度的鞣酸，醛化红细胞⽤1：100000浓度的鞣酸。程序：取红细胞，⽤PH7.2PB洗4—5遍，并⽤同液配成2.5%悬液，同时以PH7.2PB临时配制1：200000优质鞣酸，将其与红细胞悬液等量混合，37℃⽔浴咸作15min。取出后⽤ph7.2PB洗⼀次，再⽤PH7.2pB配成20%红细胞悬液。

4．致敏红细胞的制备：1）抗体致敏红细胞

取20%鞣化或未鞣化的双醛化红细胞悬液1ml，离⼼沉淀，弃去上清液，将沉淀红细胞重新悬浮于0.1mol/L.PH3.5~4.0醋酸缓冲液10ml中，加⼊等量的提纯IgG液（每毫升需含IgG100~300g）置37℃⽔浴中咸作2-4h，每15-20分钏⽤吸管轻轻吹吸混合2-3次。以ph7.2PB 洗5遍，再将沉淀红细胞⽤1%灭活免⾎清盐⽔配成0.8%悬液备⽤。—— Ab致敏红细胞悬液。2）抗原致敏红细胞

取PBS（PH6.4）4ml病毒抗原1ml，2.5%鞣酸化红细胞悬液1ml，混匀后，置室温下振荡结合30—60min（随病毒Ag种类不同）或37℃⽔浴30-45min，其间适当振摇。随后以1500rpm离⼼沉淀10min，并⽤2倍量的PH7.2PB(内含1%灭活兔⾎清)洗2遍后，配成1%的致敏红细胞悬液供试验⽤。以病毒致敏的红细胞悬液应⽴即使⽤。4℃冰箱保存，不宜超过2天。

※致敏红细胞的保存：⽤1%兔⾎清盐⽔或0.4%明胶缓冲液洗涤，并⽤其配成2.5%悬液保存备⽤。长期保存：⽤含1%糖和4%兔⾎清的⽣理盐⽔，将致敏红细胞配成10%悬液，然后于真空中冷冻⼲燥。乳胶凝集试验乳胶的预处理

取空⽩乳胶⽤PBS（PH7.4）配成2%溶液，加⼊10%的胰蛋⽩酶液，使其终浓度为1%，于56℃⽔溶作⽤18-24h，其间摇动⼏次，置4℃冰箱保存备⽤——使乳胶稳定并减少⾮特异性凝集。（离⼼上清，将沉淀⽤PBS悬浮配成2%乳胶溶液）乳胶的致敏

1．将浓缩的病毒抗原作倍⽐稀释（PBS），加⼊等量的2%空⽩乳胶中（逐滴加⼊，边加边摇动）。37℃作⽤15-30min。2．加⼊10%⽜⾎清⽩蛋⽩，使终浓度为1%，混合均匀，37℃ 15-30nin，或2h，即得乳胶抗原。

（六）标记抗体技术（免疫标记技术）

原理：抗体能追踪抗原，在抗原所在部位与之结合，⼀旦结合后就不易洗脱。但此种结合反应⾁眼不易察出。有⼀些物质在超微量时，即能⽤某种特殊理化因素将其检测出来。如将这些构标记在抗原或抗体分⼦上，就能利⽤调换体与原特异结合的特性，检测抗原或抗体，即免疫标记技术。荧光抗体技术（免疫荧光技术）分类：酶标记抗体技术（免疫酶技术）同位素标记抗体技术（放射免疫测定技术）铁蛋⽩标记抗体技术免疫荧光技术基本⽅法和原理1．直接法

将标记的特异荧光抗体，直接加在Ag标本上，经⼀定温度和时间的染⾊，⽤⽔洗去来参加反应的多余荧光抗体，室温⼲燥后封⽚，镜检。优点：⽅法简便，⾮特异荧光染⾊因素少。缺点：不够敏感，且⼀种标记抗体只能检测⼀种Ag。2．间接法

既可检查抗体，也可检查抗原。1）检查抗原

⽤已知未标记的特异抗体（⼀抗）与抗原标本进⾏反应，⽤⽔洗去未反应的抗体，再⽤标记的抗体（⼆抗）与抗原标本反应，使之形成抗原⼀抗体——抗抗体复合物，再⽤⽔洗去未反应的标记抗抗体，⼲燥封⽚后镜检。2）检查Ab

Ab标本为已知的，待检⾎清为第⼀抗体，其它步骤同上。缺点：但特异性较差。可能是间接法的中间层可结合更多的标记抗体所致。优点：敏感性⾼，且标记⼀种抗体球蛋⽩抗体，可⽤于多种抗原，抗体系统的检查。既可检测Ag，也可检测Ab。

3．补体法

应⽤补体结合反应的原理，⽤荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知Ag或未知Ab。先将未标记的Ab和补体加在Ag标本上，使其发⽣反应，随后再加标记抗体抗体，使之形成Ag— Ab —cb抗补体复合物。缺点：特异性较差。优点：敏感性⾼。标记⼀种抗体补体Ab，可⽤于各种Ag—Ab系统的检查（可⽤于各种动物）

间接法：双层法、混合法、三层法。补体法：抗体⼀抗补体法、异属补体结合法。涂⽚压印⽚、冰冻切⽚、⽯蜡切⽚、组织培养物、可溶性Ag标本（醋酸评维素膜）。放射免疫测定技术

原理：⽤放射性同位素标记已知的Ab或Ag，⽤以检测被检材料中Ag 或Ab。随后根据Ag —Ab复合物中的同位素放射性强度进⾏定性或定量的测定。优点：敏感性和特异性都很强。缺点：射线污染。分类和操作原理：（⼀）液相放射免疫测定1．直接法（Ag、Ab）

⽤放射性同位素标记病毒Ag或Ab。检测相应的Ab 或Ag。主要同于颗粒性物质，如悬浮细胞内病毒抗原的初步检测，检测Ag时，通过超速离⼼将Ag—Ab复合物沉淀下来，分别检测沉淀物和上清液中的放射性强度，检测Ab时，在Ab、Ag感作以后，再加⼊适当浓度（40-50%饱和度）的硫酸铵，叫Ag—Ab复合物盐析沉淀，⽽Ag仍处于溶解状态。2．间接法（主要⽤于病毒抗体的检测）被检⾎清+ Ag+⼆抗离⼼沉淀

3．竞争法（主要⽤于病毒抗原的检测）

被检抗原+标定浓度的特异抗体，混合咸作⼀定时间再加⼊标定量的放射性同位素标记抗原—离⼼沉淀。

（⼆）固相放射免疫测定（聚苯⼄烯⼩管或微量滴定板上，或者⽤溴化氢、⼆醛等将Ab 偶联或共价联结于琼脂糖珠或纤维素等表⾯）1．夹⼼法

Ab+待检Ag+标记Ab

2．夹⼼间接法，与上法相⽐，敏感性更强。

Ab包被+待检Ag+另⼀动物的抗病毒Ab+同位素标记的抗第⼆次Ab的抗抗体3．竞争法

Ab包被+待检抗原+标记Ag两者同时加⼊or待检Ag先加4．阻断试验法

Ab包被+已知Ag+被检⾎清+同位素标记的Ab。（三）放射免疫⾃显影

⽤同位素标记Ab or Ag，然后进⾏琼脂扩散试验或免疫电泳对流免疫电脉，检测相应的Ag or Ab。扩散或电泳完毕后，将琼脂板置于盐⽔和ddH2O中充分浸泡，除去未结合的标记Ab或Ag。⼲燥后，覆盖X光胶⽚，置暗室中曝光1-2天。经过显影和定影，即可在X光胶⽚上显⽰特异的沉淀线。免疫酶技术抗酶抗体法

放⼤抗体法：同时使⽤酶标记抗体和抗酶抗体1．酶标记抗体法1）直接法

⽤酶标记的特异性Ab，直接检测病毒或病毒Ag。在将含有uirus或virus Ag的组织和细胞标本固定的消除其中的内源性酶以后，应⽤酶标记Ab直接处理，随后滴加底物显⾊，直接镜检。2）间接法

将含有V或V Ag的组织或细胞标本，先⽤特异性V Ab处理，充分涮洗后，再⽤酶标记的抗体处理，使其形成Ag-Ab-酶标记抗体复合物，最后滴加底物，镜检。2．抗酶抗体法

不需进⾏酶的标记，⽐前都简便和灵敏1）免疫球蛋⽩桥法

搭桥：⽤⼆抗（如抗兔IgG的抗体）将抗体和已结合在病毒抗原上的同种动物（兔）特异性Ab连接起来。加酶，形成Ag+Ab+抗抗体+抗酶抗体+酶加底物显⾊、镜检。2）可溶性酶——抗酶复合物法（PAP）3）杂交抗体法

将来⾃同种动物的抗IgG抗体（或其Fab碎⽚）与抗酶抗体（或其Fab碎⽚）结合起来，使之成为⼀种具有抗IgG和抗酶双重活性的杂交抗体。再⽤这种杂交抗体进⾏免疫酶染⾊。Ag+Ab+杂交Ab+酶（⼀）免疫酶测定法

固相免疫酶测定法：利⽤固相载体，以化学的或物理的⽅法将Ag或Ab联接于其上，制成免疫吸附剂，随后进⾏免疫酶测定。

均相免疫酶测定法：不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需要载体，直接从溶液中测定结果。1．固相免疫酶测定法

根据固相载体的种类和免疫吸附剂的制备⽅法。分为两类：、

1）酶联免疫吸附试验或测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。①间接法，⽤Ag包被板⼦+Ab（未知）+抗Ab+酶底物显⾊

②双抗体夹⼼法，⽤于检测Ag。Ag+Ag（未知）+抗Ab+酶底物显⾊③竞争法：（测定Ag）

利⽤酶标记Ag和未标记Ag共同竞争有限量的Ab，测定样品中的Ag。需同时微只加酶标记Ag的系统作对照。Ab+待检Ag和酶标记Ag（与可先加待检样品，稍后再加酶标记Ag）。对照组：只加酶标记Ag。④夹⼼间接法

应⽤酶标记抗抗体测定Ag。Ab+Ag（待检）+不同种动物的同的Ab+酶标抗第⼆种抗体的动物球蛋⽩（⼆抗）2）特定Ag基质球法（Defined antigen substrate sphere, DASS）

应⽤溴化氰活化的琼脂糖球作为固相载体，将Ag或Ab结合于其上，制成免疫吸附剂。2．均相酶免疫试验（酶放⼤免疫试验）

利⽤竞争原理，将含有⼩分⼦半Ag的样品，酶标半Ag及相应Ab混合感作，随后测定酶的活性。如果样品中主要⽤于激素、抗菌素和吗啡微⽣物等⼩分⼦半Ag的检测，没有半Ag，则酶标半Ag与Ab结合，酶的活性受到抑制。ELISA的操作要领：1．固相载体的选择聚苯⼄烯微量反应板PVC塑料软板

硝酸纤维素膜，斑点——ELISA（Dot—ELISA）

疏⽔聚酯布，布——ELISA（C-ELISA）2．预备试验

确定酶结合物、包被抗原或抗体的最适浓度，底物的最适反应时间。1）酶结合物的确定

⽤PH9.6的碳的酸盐缓冲液将IgG稀释⾄100ug/ml,加⼊固相载体的每⼀孔中进⾏包被,洗涤后将酶结合物以

1:200,1:400,1:800……作系列稀释,依次加⼊各孔,每⼀稀释度加2孔。反应完毕后加底物显⾊，以能产⽣光吸收值（A）为1.0的稀释度为结合物的最适浓度。2）包被蛋⽩质浓度的确定

将欲包被的蛋⽩质⽤PH9.6的碳酸盐缓冲液作1：10，1：20，1：40…….系列稀释，每⼀稀释度包被2个孔，然后进⾏常规的ELISA操作。以能产⽣光吸收值（A）为1.0的稀释度为包被蛋⽩质的最适浓度。3）底物最适作⽤时间的测定

以最适稀释度Ag和酶结合物进⾏试验，加⼊底物后在不同时向终⽌反应，即可确定最适反应时间。3．包被1）载体

2）包被液的PH：通常⽤PH9.5~9.6,0.05mol.L or 0.1mol/L的碳酸盐缓冲液稀释Ag or Ab。吸咐时的PH⼀般为9.0左右。如PH较低，则吸附时间延长，但PH低于6.0则⾮特异性吸附增加。3）吸附时间与温度，⼀般为4℃过夜，有时也可采⽤37℃吸附1-5h。

4）蛋⽩质浓度，在固相载体上，每孔加⼊量⼀般为0.1-100us/ml。浓度太⾼，令固Ag或Ab蛋⽩分⼦之间的相互作⽤较⼤⽽影响载体对蛋⽩质的吸附，浓度太低，则感染性下降。4．洗涤，将载体各也甩⼲，再加洗涤充满各孔，静置3-7min如此重复3次。

常⽤的洗涤液：含有0.05%吐温-20，0.01mol/L PH7.4的PBS或含有0.05%吐温-20，0.01mol/L PH7.4的Tris-cl。5．封闭

抗原或抗体包被后，载体表⾯仍可能遗留有未吸附蛋⽩质的空⽩位点，从⽽造成下⼀步的⾮特异性吸附。封闭液： 1%-3%⽜⾎清⽩蛋⽩，3%-5%脱脂乳，10%⽜或马⾎清加⼊封闭液后，37℃吸附2h，然后洗涤。6．结果判定1）⽬视⽐⾊法：定性

2）光电⽐⾊法：P/N⽐法，P/N值≥2.0为阳性

（七）聚合酶链反应（PCR）与疾病诊断聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是1985年Mallis等根据核酸⾃然扩增的原理，建⽴的⼀种⼈⼯体外扩增DNA技术，⽬前已⼴泛应⽤于病毒学研究及病毒病的诊断。基本原理

PCR⼜称为体外酶促基因扩增，即在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外扩增反应，其原理类似于天然DNA的复制。双链靶DNA分⼦变性后解链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合，在4种dNTP 存在和合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物由5’――3’扩增延长，每经过变性、复性、延伸⼀个循环，模板DNA增加1倍，新合成的DNA链⼜可作为下⼀循环的模板，经过30-50个循环，可使原DNA量增加106-109倍。由于引物的序列决定了扩增的范围，⽽数⼗个循环，⼜使原DNA模板⼤量增加，因此，PCR具有特异、敏感等许多优点，适⽤于病毒性疾病的诊断。主要步骤

PCR的每⼀个循环包括变性、复性、延伸3个步骤。

1）变性通过加热（90-95℃），使双链DNA模板的氢键断裂，双链解离成单链。2）复性适当降温（42-62℃），使引物与其互补的模板在局部形成杂交DNA双链。

3）延伸72℃，在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸底物及Mg+离⼦存在的条件下，引物延长，新链合成。⼏种模板的处理⽅法1. 细菌

挑细菌于离⼼管中，加适量ddH2O，涡悬，于沸⽔浴中变性10min，迅速置冰浴中，然后3000rpm离⼼数秒，取上清作为模板。2. 细胞培养物

收集病变的细胞（不要冻融）悬液，10000rpm离⼼数秒，取细胞沉淀⽤适量Sample Buffer 悬浮，加⼊蛋⽩酶K⾄终浓度为100µg/ml，于37℃温箱中作⽤1h，取出于沸⽔浴中变性10min,⽴即置冰浴中，3000rpm离⼼数秒,取上清作为模板。Sample Buffer终浓度KCl 50mM

Tris-HCl(pH9.0) 10mMMgCl2 1.5mM明胶 0.01%Triton X-100 0.1%NP-40 0.45%Tween 20 0.45%3. 质粒、病毒基因组DNA

沸⽔浴中变性10min，迅速置冰浴上备⽤。4.病料与⿐拭⼦

1)⽤匀浆器将病料组织充分匀浆，⽤TEN缓冲液按1:5进⾏稀释。2)收集悬液于离⼼管内，-20℃反复冻融三次。3)取出，5000rpm离⼼5min。

4)取472.5µl上清液于另⼀离⼼管中，加⼊25µl 10%的SDS(终浓度为0.5%)和2.5µl 20mg/ml的蛋⽩酶K(终浓度为100µg/ml)，混匀。5)50℃⽔浴过夜

6)⽤等体积(500µl)的苯酚:异戊醇、苯酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提⼀次7)吸取上清，加2倍体积的⽆⽔⼄醇、0.1倍体积的3M NaAc于－20℃沉淀30min，10000rpm离⼼10min。

8)沉淀⽤70%⼄醇洗⼀次，真空抽⼲，⽤20µl ddH2O溶解，－20℃保存备⽤。9)