XIAP和caspase-9在子痫前期患者胎盘中的表达

中华临床医师杂志(电子版)2015年12月第9卷第23期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),December 1,2015,Vol.9,No.23

²临床论著² XIAP和caspase-9在子痫前期患者 胎盘中的表达

杨涛涛 杨元元 王文君 王永红

【摘要】 目的 探讨抑制凋亡蛋白XIAP及caspase-9的表达与胎盘滋养细胞凋亡的关系。方法 选取2013年4至12月于山西医科大学第二临床医院妇产科住院分娩的孕妇，其中25例子痫前期重度患者作为研究组，另外选取25例正常晚期妊娠妇女作为正常对照组，收集患者全部临床资料和分娩时的胎盘组织。用免疫组织化学二步法及Western blot检测XIAP和caspase-9在胎盘组织中的定位及表达，并用BI-2000医学图像分析系统对图片进行处理。统计分析采用SPSS 17.0两独立样本t检验进行统计学处理。结果 两组临床资料的比较：研究组与正常对照组在年龄（t＝－0.95，P＞0.05）及孕龄（t＝1.99，P＞0.05）上差异无统计学意义；在收缩压（t＝－8.64，P＜0.01）、舒张压（t＝－8.09，P＜0.01）、新生儿出生体重（t＝6.59，P＜0.01）、新生儿评分（t＝7.56，P＜0.01）之间差异有统计学意义。免疫组化检测结果：两组孕妇胎盘滋养细胞的胞质中均可见XIAP和caspase-9的阳性表达。子痫前期组胎盘滋养细胞中XIAP的表达的OD值显著低于正常对照组（0.23±0.03 vs. 0.34±0.04，t＝－11.12，P＜0.01）；caspase-9的表达高于正常组（0.32±0.04 vs. 0.26±0.05，t＝－5.23，P＜0.01）。Western blot检测结果：子痫前期组胎盘滋养细胞中XIAP的表达低于正常对照组（灰度值0.36±0.14 vs. 0.96±0.43，t＝－3.00，P＜0.05）；子痫前期组胎盘滋养细胞中caspase-9的表达高于正常对照组（灰度值2.58±0.47 vs. 1.66±0.19，t＝－3.69，P＜0.05）。结论 子痫前期重度患者胎盘滋养细胞的胞质中抑制凋亡蛋白XIAP的表达下调，caspase-9表达升高，提示XIAP通过影响caspase-9导致滋养细胞凋亡增加可能与子痫前期的发病有关。

【关键词】 X连锁凋亡抑制蛋白质； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9； 胎盘； 子痫前期； 滋养细胞

Expression of X chromosome linked inhibitor of apoptosis protein and caspase-9 in placenta trophoblast cells of pregnant women with preeclampsia Yang Taotao, Yang Yuanyuan, Wang Wenjun, Wang Yonghong. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Corresponding author: Wang Yonghong, Email: wangyh19672000@126.com

【Abstract】 Objective To investigate the role of XIAP and caspase-9 in the apoptosis of placental trophoblast cells. Methods From April 2013 to December 2013, 25 healthy pregnant women and 25 pregnant women with preeclampsia underwent cesarean section in the Second Hospital of Shanxi Medical University were collected. Collected the clinical information and the childbirth placenta tissue of all enrolled pregnancies. Two-step immunohistochemical detection was used to test the expression and the localization of XIAP and caspase-9 in placenta of two groups, and the image was processed by BI-2000 medical image analysis system. The relative expression of XIAP and caspase-9 in the placental tissue were detected by Western blot. Two-sample t test was used for statistical analysis. Results Age(t＝-0.95, P>0.05) and gestational weeks (t＝1.99, P>0.05) in two group had no significant differences, while the systolic blood pressure (t＝-8.64, P<0.01), diastolic blood pressure (t＝-8.09, P<0.01), birth weight (t＝6.59, P<0.01) and Apgar score (t＝7.56, P<0.01) in the two groups were markedly different. Immunohistochemical detection results: expression of XIAP in preeclampsia pregnant women was

DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2015.23.017

作者单位：030001 太原，山西医科大学第二医院妇产科 通讯作者：王永红，Email: wangyh19672000@126.com

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decreased compared with that in healthy pregnant women (OD value 0.23±0.03 vs. 0.34±0.04, t＝-11.12, P<0.01). Expression of caspase-9 was higher in preeclampsia pregnant women compared with that in healthy pregnant women (OD value 0.32±0.04 vs. 0.26±0.05, t＝-5.23, P<0.01). Western blot test results: expression of XIAP in preeclampsia pregnant women was decreased compared with that in healthy pregnant women (Gray value 0.36±0.14 vs. 0.96±0.43, t＝-3.00, P<0.05). Expression of caspase-9 was higher in preeclampsia pregnant women compared with that in healthy pregnant women (Gray value 2.58±0.47 vs. 1.66±0.19, t＝-3.69, P<0.05). Conclusion Low expression of anti-apoptotic protein XIAP and high expression of caspase-9 prompted that XIAP inhibit caspase activity may associate with the pathogenesis of pre-eclampsia.

【Key words】 X-linked inhibitor of apoptosis protein; Caspase-9; Placenta; Pre-eclampsia; Trophoblast cell

子痫前期是妊娠期常见的特发性多脏器损害性疾病。研究结果发现滋养细胞细胞凋亡被认为是其可能的发病机制之一[1]。Jeon等[2]对体外细胞研究发现抑制凋亡蛋白。X连锁的抑制凋亡蛋白（X chromosome linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的表达减少导致胎盘滋养细胞的过度凋亡可能参与子痫前期的发病过程，但下游机制不明。XIAP是凋亡抑制蛋白家族中最具有调控能力的抑制凋亡蛋白，具有三个N端的重复序列结构域（BIR）和一个C端的锌指结构域（RING），Suzuki等[3-4]研究证实XIAP能抑制caspase-3及caspase-7的活性。Caspases激活参与细胞凋亡最常见的途径是线粒体释放凋亡蛋白酶活化因子（Apaf-1）和细胞色素C[5]。Apaf-1负责激活caspase-9，进而激活caspase-3，caspase-7等导致细胞破坏[6]。本实验通过免疫组织化学和Western blot方法分别对XIAP和caspase-9在胎盘滋养细胞中的表达进行定位与定量研究，探讨XIAP是否通过影响caspase-9的激活导致子痫前期发病的发生。

资料与方法

一、研究对象

选择2013年4至12月在山西医科大学第二医院产科收治的子痫前期重度患者25例作为研究组，正常晚期孕妇25例作为正常对照组。入选标准：所有入选研究对象均为单胎妊娠的初产妇，均为剖宫产终止妊娠，子痫前期重度患者的诊断标准参考第8版《妇产科学》。排除标准：多胎妊娠、多产、感染、原发性高血压、妊娠期糖尿病、心脏病、肝肾疾病、妊娠合并免疫系统疾病史，患有其他妊娠合并症及并发症。对照组平均年龄（27.96±2.17）岁，平均孕周（37.78±1.98）周；研究组平均年龄（28.84±4.12）岁，平均孕周（36.78±1.49）周。

二、标本采集

胎盘娩出后，立即从胎盘的母体面切取组织约1 cm³1 cm³1 cm，共6块；取组织时注意避开梗死灶及钙化点，用生理盐水反复冲洗干净，2块固定于10%的中性福尔马林溶液中，24 h后送病理科行石蜡包埋，用于免疫组织化学实验；4块速冻于液氮中，24 h后保存于－80 ℃冰箱中，用于Western blot实验研究。

三、实验方法

1. 免疫组织化学：用免疫组织化学方法检测XIAP和caspase-9在胎盘组织中的定位。（1）抗体：一抗为鼠抗人的单克隆抗体（货号XIAP：sc-55550，caspase-9：sc-73548），二抗为羊抗鼠（货号sc-2005），均购于Santa Cruz公司；（2）胎盘组织的石蜡切片经常规脱蜡、水化，用3% H2O2处理后，于枸橼酸钠缓冲液中进行抗原修复，加入鼠抗人IgG抗体（抗体稀释浓度为1∶50），37 ℃孵育2 h后，滴加二抗（抗体稀释浓度为1∶50），37 ℃孵育30 min，二氨基联苯胺四盐酸（DAB）显色，苏木素复染，常规脱水封片。显微镜下观察黄褐色颗粒进行表达定位，测量OD值半定量研究。

2. Western blot：用Western blot定量检测XIAP和caspase-9在胎盘中的相对表达量。取200 mg胎盘组织，在液氮中碾成粉末，加入7 ml蛋白裂解液，置冰上1 h后，14 000 r/min，15 min，4 ℃，离心，吸取上清液，－20 ℃保存备用。制备8%的SDS-PAGE，蛋白样本与蛋白上样缓冲液混合，100 ℃变性10 min，加样电泳，之后转膜，将PVDF膜置于脱脂奶粉溶液中封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，用TBST溶液洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h，在双色红外荧光扫描成像系统（美国LI-COR）下扫描并分析，并以β-actin的灰度值作为内参进行结果的均一化处理，得到XIAP和caspase-9的相对

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表1 两组孕妇一般资料比较（xs）

组别 子痫前期组 对照组 t值 P值

例数 25 25

年龄 (岁) 28.84±4.12 27.96±2.17 -0.95 >0.05

孕龄 (周) 36.78±1.49 37.78±1.98 1.99 >0.05

收缩压 (mmHg) 160.80±17.13 126.36±10.17

-8.64 <0.01

舒张压 (mmHg) 102.44±15.24 75.80±6.17 -8.09 <0.01

血红蛋白 (g/L) 115.52±15.55 115.56±11.24

0.01 >0.05

血小板计数 (×10/L) 218.71±70.55 215.8±55.93

0.16 >0.05

9

新生儿 体重(g) 2 186.4±656.28 3 284.2±524.53

6.59 <0.01

新生儿 评分 8.00±1.08 9.76±0.44 7.56 <0.01

灰度值。

四、统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，本研究中所测实验结果及相关临床资料均用均数±标准差（xs）表示。研究组与对照中的有关临床数据和XIAP在两组间的差异性表达均采用两独立样本t检验进行统计， P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、孕妇一般资料

两组孕妇一般资料比较见表1。

二、XIAP在子痫前期重度患者和正常晚期孕妇胎盘中的表达

1. 免疫组织化学方法（二步法）检测XIAP在胎盘中的表达位置：结果显示，XIAP主要表达于滋养细胞的胞质中，呈黄褐色颗粒，对照组中比研究组中的表达阳性更强。见图1。子痫前期组胎盘滋养细胞中XIAP的表达（OD：0.23±0.03）显著低于正常对照组（OD：0.34±0.04），差异有统计学意义（t＝－11.12，P＜0.01）。见表2。

表2 免疫组化XIAP及caspase-9在研究组和对照组胎盘组

织中的表达（MOD，xs，³400）

组别 例数 XIAP的表达 caspase-9的表达 研究组 25 0.23±0.03 0.32±0.04 对照组 25 0.34±0.04 0.26±0.05 t值

-11.12 -5.23 P值

<0.01

<0.01

2. Western blot方法检测XIAP在研究组与对照组胎盘组织中的定量表达：子痫前期组胎盘滋养细胞中XIAP的表达（灰度值：0.36±0.14）低于正常对照组（灰度值：0.96±0.43），差异有统计学意义（t＝-3.00，P＜0.05）。见表3，图2。

三、caspase-9在子痫前期重度患者和正常晚期孕妇胎盘中的表达

1. 免疫组织化学方法（二步法）检测caspase-9在胎盘中的表达位置：结果显示，caspase-9主要表

表3 在Western blot的结果中分析XIAP及caspase-9

在两组胎盘组织中的表达（xs）

组别 例数 XIAP的表达量 caspase-9的表达量

研究组 4 0.36±0.14 2.58±0.47 对照组 4 0.96±0.43 1.66±0.19 t值 -3.00 -3.69 P值

<0.05

<0.05

达于滋养细胞的胞质中，呈黄褐色颗粒，研究组中caspase-9的表达显著高于正常对照组。见图3。子痫前期组胎盘滋养细胞中caspase-9的表达（OD：0.32±0.04）显著高于正常对照组（OD：0.26±0.05），差异有统计学意义（t＝－5.23，P＜0.01）。见表2。

2. Western blot方法检测caspase-9在研究组与对照组胎盘组织中的定量表达：子痫前期组胎盘滋养细胞中caspase-9的表达（灰度值：2.58±0.47）高于正常对照组（灰度值：1.66±0.19），差异有统计学意义（t＝-3.69，P＜0.05）。见表3，图4。

讨 论

子痫前期是临床最常见的严重妊娠相关特发性疾病，是造成孕产妇死亡的重要原因之一。目前研究结果表明，子痫前期并非单一的疾病，而是累及多个脏器和系统，如：肝、肾、凝血系统及神经系统等的复杂综合征[7]。子痫前期孕妇的临床表现与胎盘的发生发展有关，会随着胎儿及胎盘的娩出而迅速减轻，提示胎盘的变化在子痫前期的发展中占主要地位[6,8-9]。He等[9-11]报道，子痫前期患者的胎盘组织中存在着滋养细胞的凋亡现象，滋养细胞的过度凋亡，导致绒毛植入过浅，影响胎儿-胎盘的循环，进而导致子痫前期的发生。因此，子痫前期发病和进展与滋养细胞凋亡密切相关。

正常的机体，促凋亡与抑制凋亡保持着动态平衡。滋养细胞的存在与凋亡对维持妊娠有着很重要的作用，在正常的胎盘组组织中可见凋亡蛋白caspase-9的表达[12]。Arroyo等[13]细胞研究结果表明，caspases在启动和执行凋亡级联反应中起核心作用，控制其活性对细胞的凋亡至关重要。Jeon等[2]研

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究发现，离体滋养细胞在缺氧的条件下，caspase-9的表达会显著增高。Longtine等[14]研究发现，子痫前期孕妇的胎盘绒毛中caspase调控的凋亡增加。本研究结果显示，caspase-9在子痫前期患者和正常孕妇胎盘滋养细胞的胞质中均有表达，且在子痫前期患者胎盘组织中的表达显著高于正常孕妇对照组，通过Western blot实验方法也同样证实在子痫前期患者胎盘组织中caspase-9的异常表达。以上结果和国外体外研究的结果一致。

XIAP是线粒体凋亡途径重要的抑制蛋白，表达于正常妊娠孕妇胎盘组织滋养细胞中，并在滋养细胞的凋亡调节中起重要作用[15]，且在妊娠前三个月细胞滋养层逐渐消失融合成合体滋养层时表达增多[13]。研究表明，在缺氧情况下，XIAP在胎盘滋养细胞中的表达下降，滋养细胞的凋亡增加。随着子痫前期的加重，抑制凋亡蛋白XIAP在胎盘滋养细胞中的表达下降也越明显[13]。有动物研究结果表明，子痫前期模型大鼠近分娩时滋养细胞凋亡处在最高峰，XIAP表达明显下降[15]。

本实验通过免疫组织化学方法的定位检测结果显示，XIAP主要表达于研究组和对照组患者胎盘滋养细胞的胞质中，和国外的研究报道结果一致。Western blot方法的半定量检测结果显示，XIAP在子痫前期重度患者胎盘组织滋养细胞中的表达显著低于正常妊娠的孕妇，而且结合同时检测的子痫前期组孕妇caspase-9的表达显著增高，提示XIAP蛋白表达减少可能是作用于caspase-9使其表达增加激活凋亡途径的下游蛋白而导致滋养细胞的凋亡增加，与子痫前期的发生有密切联系。

（本文图片见光盘）

参 考 文 献

[1] Sharp AN, Heazell AE, Baczyk D, et al. Pre-eclampsia is associated

with alterations in the p53-pathway in villous trophoblast[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e87621.

[2] Jeon SY, Lee HJ, Na KH, et al. Hypoxia-induced downregulation of

XIAP in trophoblasts mediates apoptosis via interaction with IMUP-2:

implications

for

placental

development

during

preeclampsia[J]. J Cell Biochem, 2013, 114(1): 89-98.

[3] Suzuki Y, Nakabayashi Y, Nakata K, et al. X-linked inhibitor of

apoptosis protein (XIAP) inhibits caspase-3 and -7 in distinct modes[J]. J Biol Chem, 2001, 276(29): 27058-27063.

[4] Verhagen AM, Coulson EJ, Vaux DL. Inhibitor of apoptosis proteins

and their relatives: IAPs and other BIRPs[J]. Genome Biol, 2001, 2(7): REVIEWS3009.

[5] Ferraro E, Corvaro M, Cecconi F. Physiological and pathological

roles of Apaf1 and the apoptosome[J]. J Cell Mol Med, 2003, 7(1): 21-34.

[6] Sandgren JA, Scroggins SM, Santillan DA, et al. Vasopressin: The

Missing Link for Preeclampsia?[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2015, 309(9): R1062-1064.

[7] Nishizawa H, Ota S, Suzuki M, et al. Comparative gene expression

profiling of placentas from patients with severe pre-eclampsia and unexplained fetal growth restriction[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2011, 9: 107.

[8] Kanter D, Lindheimer MD, Wang E, et al. Angiogenic dysfunction in

molar pregnancy[J]. Am J Obstet Gynecol, 2010, 202(2): 184. e1-5. [9] He G, Xu W, Chen Y, et al. Abnormal apoptosis of trophoblastic cells

is related to the up-regulation of CYP11A gene in placenta of preeclampsia patients[J]. PLoS One, 2013, 8(3): e59609. [10]

Yang X, Guo L, Li H, et al. Analysis of the original causes of placental oxidative stress in normal pregnancy and pre-eclampsia: a hypothesis[J]. J Matern Fetal Neonatal Med, 2012, 25(7): 884-888. [11]

Cali U, Cavkaytar S, Sirvan L, et al. Placental apoptosis in preeclampsia, intrauterine growth retardation, and HELLP syndrome: an immunohistochemical study with caspase-3 and bcl-2[J]. Clin Exp Obstet Gynecol, 2013, 40(1): 45-48. [12] [13]

徐佳. MAPK信号转导通路及凋亡蛋白在子痫前期中的研究[D]. 西安: 第四军医大学, 2012.

Arroyo J, Price M, Straszewski-Chavez S, et al. XIAP protein is induced by placenta growth factor (PLGF) and decreased during preeclampsia in trophoblast cells[J]. Syst Biol Reprod Med, 2014, 60(5): 263-273. [14]

Longtine MS, Chen B, Odibo AO. et al, Villous trophoblast apoptosis is elevated and restricted to cytotrophoblasts in pregnancies complicated by preeclampsia, IUGR, or preeclampsia with IUGR[J]. Placenta, 2012, 33(5): 352-359. [15]

Arroyo JA, Anthony RV, Galan HL. Decreased placental x-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) in an ovine model of intrauterine growth restriction (IUGR) [J]. Am J Obstet Gynecol, 2008, 199(1): 80. e1-8.

（收稿日期：2015-05-18）

（本文编辑：戚红丹）

杨涛涛，杨元元，王文君，等. XIAP和caspase-9在子痫前期患者胎盘中的表达［J/CD］. 中华临床医师杂志：电子版，2015，9（23）：4339-4343.