上图是常规的转基因子粒载体，从图上可以看到，该载体包括增强子、启动子、CDNA 及 PolyA 。将其串联起来，共同形成转基因载体。
（一）、启动子类型
在设计单纯转基因动物的过程中，启动子的类型非常重要，因为根据实验的目的，如果超水平表达，可以选择构成性的表达启动子。这类启动子可以不受调控，在所转入的细胞进行高水平的表达。如 CMV启动子，SV40 启动子，这两个启动子是常用于超水平表达特定的基因。
第二类是组织特异性表达启动子，这类启动子由于组织特异性活性，只在特定的组织细胞有活性，来启动特定基因的转录。比较典型的有只在内皮细胞有活性的 TIE2 启动子，还有只在星形细胞有活性的GFAP 启动子。如果需要制备一个只在某一个组织器官特异性表达的基因，可以首先去选择只在这个组织器官有特异性活性的启动子。
第三类，是诱导性表达的启动子。有时需要表达的靶基因只是在某个时项，如在成年或者在某一阶段开始表达。可以选择一些启动子，该启动子只是在外源性化合物，给入诱导的情况下，才能够具有表达活性。如四环素诱导的启动子，只有给小鼠注入四环素的情况下才能够使该启动子具有表达活性，从而来控制靶基因的表达。
（二）、转基因注射流程
上图是转基因小鼠制备的主要流程。当构建转基因载体后，需要把转基因载体通过分子生物学的手段
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进行扩增、存放，然后将环状的质粒载体，进行线性化。随后准备超排卵的实性小鼠，将其受精卵分离，通过微注射的方式将转基因载体注入受精卵的核内，然后再将微注射的受精卵重新植入假孕的小鼠子宫内，发育成子代小鼠。
这样获得的子代小鼠中，会有一定比例的小鼠，其细胞核内含有所转入的目的基因。通过分子生物学手段，如 PCR ，或者 Western blot 技术，来鉴定哪些个体含有转入的目的基因。
（三）、模型 1：AQP4 超表达转基因小鼠1 、水通道 AQP4 在脑星形胶质细胞膜表达
这种小鼠是由 GFAP 启动子调控水通道蛋白 AQP4 ，在小鼠脑内星形胶质细胞超表达。利用这个模型，可以研究水通道4 在脑水肿发病过程中的作用。
因为在前期工作中已经知道水通道 AQP4 ，在脑的星形胶质细胞膜呈高水平表达。当水通道 AQP4 被敲除后，研究发现，水通道 AQP4 经敲除的小鼠在脑水肿发病的过程中慢于正常小鼠。据此推测，水通道 AQP4 在脑水肿形成过程中，起非常重要的作用。当其被敲除时，脑水肿进程会延缓。如果水通道 AQP4 高表达是否会加速脑水肿进程，据此又设计了如下的转基因小鼠模型。
2 、AQP4 转基因载体构建
如上图所示，首先构建水通道 AQP4 转基因载体。这个载体包括水通道蛋白 4 的 CDNA 部分， 3'端非编码序列部分，包括 PolyA 序列。还有 GFAP 的启动子，该启动子在脑星形胶质细胞具有特异性表达活性。另外，由于需要将 AQP44 在脑内进行超水平表达，所以在启动子前面加了一个增强子。然后把这些部分亚克隆到 PGEM3Z 质粒中，这样就构建了转基因的载体。
通过转基因载体的微注射，将注射后的受精卵细胞植回到母鼠的子宫内，发育成小鼠，在实验中共获得了 42 个小鼠。通过基因组 DNA 的 PCR 检测， 用 GFAP 启动子和 AQP44 的 CDNA 中的序列，合成了一对引物。通过这个引物可以检测含有目的基因的小鼠。通过基因组 DNA 的 PCR 检测，在 42 个子代小鼠当中发现了 4 个含有阳性片断的小鼠。
3 、AQP4 转基因小鼠基因型鉴定
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上图是 PCR 结果，发现其中有的 PCR 产物的条带增强，有的减弱。发生这种情况是因为单纯的转基因小鼠，注入的转基因载体随机的整合入小鼠的基因组，在转入基因组的过程中，可能只有一个拷贝进入基因组，也可能有多个拷贝同时进进入基因组。所以通过基因组PCR 检测，可以推断该转基因载体整合入基因组中的数量。然后可以选择整合数量较多的个体进行扩增。对这几个阳性表达的小鼠进行了保留，然后将该小鼠与野生型小鼠进行交配，再次获得了它们的子代。对子代水通道AQP4 的表达水平，进行了检测。发现其父母代基因组 PCR 表达 DNA 最强的小鼠，子代水通道 AQP4 的表达水平也最高。
4 、AQP4 在转基因鼠脑超表达
上图是水通道 AQP4 的 MRNA 表达水平和蛋白质表达水平，左图是转基因小鼠，其水通道 AQP4 的表达水平可以是野生型小鼠的三倍以上。右图是用 Western blot 的方法表示的水通道 AQP4 的蛋白表达水平。可以看出，该转基因小鼠所表达的水通道AQP4 蛋白质，明显高于的野生型小鼠。同时，水通道 AQP4基因敲除的小鼠，也做了对照。基因敲除小鼠没有水通道 AQP4 的表达，所以从结果可以断定，转基因小鼠可以表达正常的水平水通道 AQP4 , 并且其表达水平远远高于野生型小鼠。
5 、AQP4 蛋白在脑内的表达定位
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用免疫染色的方法，分别用水通道 AQP4 的抗体、GFAP 的抗体、及 DNPI 染料（可以染核），对水通道 AQP4 及 GFAP 蛋白在脑内定位，见上图。因为GFAP 蛋白只在星形胶质细胞表达，如果水通道 AQP4和它共同定位，说明它们在同样的细胞中表达。如果定位不同，可能在星形细胞外，还有转基因导致的水通道 AQP4 的表达。通过免疫染色的结果，发现它们所表达的细胞是相同的，所以认为转入基因所产生的水通道 AQP4 ，在神经星形胶质细胞定位表达。所以，从表达水通道 AQP4 的长度和表达定位来看，该转基因小鼠模型是成功的。6 、AQP4 超表达对脑水肿发生的影响水通道 AQP4 转基因小鼠，在脑水肿发生过程中病程明显快于野生型小鼠。并远远快于水通道 AQP4基因敲除的小鼠，最后作出结论，水通道 AQP4 在脑水肿形成过程中，起非常重要的作用。三、基因打靶基因打靶技术，是利用 DNA 同源重组的原理，在体外培养的小鼠的干细胞用突变的靶基因同源序列，来取代正常基因。即在体外构建一个与所要打靶的基因相同序列的载体。然后用该载体去置换基因，把正常的基因换成突变的基因。这样可以来阻止正常的基因表达，也就是常说的基因敲除小鼠。或者用点突变的基因去置换正常的基因，让小鼠去表达突变基因所产生的蛋白，这就是基因敲入小鼠模型。还可以通过不同策略，来建立条件基因敲除（包括组织特异性基因敲除和可诱导性基因敲除）、可诱导性基因敲入模型等，见下图。基因打靶载体构建时，需要在中间加上抗性基因，这个抗性基因的作用是什么呢？5基因打靶载体主要有以下几个部分组成。1 、与打靶基因序列相同的同源序列。该同源序列可以与需要打靶的基因进行同源重组。把该同源序列分成两段，在中间放上一个抗性基因。因为进行基因打靶时，效率非常低，可能只有百万分之一。即对干细胞进行基因打靶，可能只有百万分之一的细胞，能够正确的在打靶位点，即打靶载体置换正常基因。如果有抗性基因，就可以给加入抗性基因相对应的化合物。该化合物可以杀伤正常的 ES 细胞。但是有抗性基因存在，该抗性基因就可以产生能够分解、消除外加毒性化合物的作用，来保证表达基因产物的细胞成活。所以该抗性基因可以作为标记物，来筛选打靶阳性的细胞克隆。基因打靶载体构建时，还需要在中间加上自杀基因，这个自杀基因的作用是什么？2 、自杀基因自杀基因是使打靶载体能够准确置换靶基因。前面提到的单纯转基因小鼠，其转基因载体可以随机地整合到基因组中。基因打靶载体也有可能随机整合到基因组中。如果没有标记物，不知道是随机整合还是打靶的位点整合。所以，选择了自杀基因。自杀基因的作用可以作为基因打靶准确性的标记物。如果是基因打靶载体准确的通过同源重组来置换靶基因，其只是同源序列，即所设计的同源序列，中间夹的抗性基因部分，能够整合到打靶的位点。自杀基因由于在同源序列的外边，在重组时会被去掉。如果是随机整合，不存在同源重组。所以自杀基因和打靶载体都随机插入到整合位点。自杀基因的存在就可以产生一些毒性的蛋白，其可以把这个宿主细胞杀死。所以这种随机整合与打靶载体细胞不能够在正常情况下存活，细胞会死亡。所以所得到的利用抗性基因产物筛除的阳性基因的克隆，就是准确基因打靶的克隆。在选同源序列时有这样的一个原则,同源序列分成一个长臂和一个短臂,最佳的长臂长度是 3-6 kb ，因为 DNA 同源序列的 DNA 越长，同源重组的机会越高。但是这也存在矛盾，如果长臂过长，在制作载体时，相对难度较大，操作起来较难。另一个是短臂，在基因打靶之后，要做基因组 PCR 鉴定。所以，这两个引物之间的距离，不应该太长，如果过长， PCR 的效率会降低。所以短臂要小于 2 kb ，这样适合做基因组 PCR 。所以，基因打靶载体包括长臂和短臂，及中间的抗性基因来进行同源重组。3 、基因打靶产生转基因鼠的步骤首先是设计和构建基因打靶载体，这是最重要的步骤。这需要科研人员根据基因的特性，及整个的实验目的来进行设计。然后进行胚胎干细胞，即 ES 细胞的基因打靶，这个实验主要由技术人员操作，这样效率较高。然后筛选基因打靶的阳性细胞，再将基因打靶阳性 ES 细胞注射进入桑肾胚。然后产生嵌合体的桑肾胚，再把桑肾胚的嵌合体植入到假孕的母鼠。该假孕的母鼠就可以生产出嵌合体的子代小鼠。因为基因打靶的 ES细胞主要注射在桑肾胚阶段，这时，会产生 8-16 个胚胎细胞。从这个比例看，可能就在子代小鼠中，体细胞或生殖细胞有 1/8-1/16 ，带有打靶基因的的体细胞。所以即使是阳性，通过基因组 PCR 检测出阳性的小鼠，因为并不是小鼠所有的体细胞都带有基因打靶的基因，只有 1/8-1/16 的体细胞和生殖细胞含有打靶基因。所以要进行进一步的筛选，通过把嵌合体小鼠与野生型小鼠进行交配，获得含有打靶基因通过生殖细胞传递给子代的个体。经过这一代的筛选，所得到的阳性小鼠，叫做杂合性小鼠，或者叫杂合子6小鼠。杂合子小鼠每一对的等位基因中，其中有一个是基因打靶的基因，一个是正常基因。然后，把这种杂合子小鼠进行交配，交配之后，会有 1/4 的小鼠是纯合子小鼠。即 1/4 的小鼠每一对等位基因呢都是经过基因打靶的。有一半的小鼠还是杂合子，即还有等位基因中的一个是被打靶的，一个是野生型的，另外还有 1/4 是野生型的。所以通过这些步骤，就可以获得基因打靶纯合子小鼠。纯合子小鼠的等位基因都是受打靶的，所以可能不表达靶基因所产生蛋白，或者是表达突变的蛋白。这就是基因打靶的整个过程。
上图是基因打靶总过程的总解，每一个步骤都需要耗费时间的，所以，即使整个实验都很顺利，从设计载体到基因打靶，然后从微注射，最后到小鼠，整个过程都很顺利的话，也需要一年的时间。如果在某一步遇到困难，可能时间还要延长。所以在计划研究工作时，需要把进行的时限预先设定。
四、基因敲除
基因敲除是通过基因打靶敲除部分或者整个基因，阻止其蛋白的表达。主要用于研究特定基因在体内的生理功能。下面举例实验室建立基因敲除小鼠模型。
上图是尿素通道蛋白 UT-B 基因敲除的打靶载体。首先要克隆尿素通道蛋白 UT-B 的基因，然后设计和构建水通道，尿素通道蛋白 UT-B 的打靶载体。把该基因的外显子，即内含子 -2 这一部分作为打靶的短臂，把内含子 -6 的部分序列作为长臂，中间加上青霉素的抗性基因，构建打靶载体。用 PGK 、 PK作为自杀基因，然后构建载体。然后通过基因打靶，获得将 UT-B 基因一部分置换的打靶基因。
右图是基因打靶后，用 Western blot 来确定，打靶的位置是正确的。然后，分别用 Western blot和这个免疫组化，对打靶的效果进行鉴定。从 Western blot 的结果来看，其 MRA 表达情况，野生型和
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杂合子的小鼠比较，纯合子基因敲除小鼠的 MRA 的长度明显缩短，正常情况下 MRA 是两条带，可以看出基因打靶之后 MRA 还是两条带，但是都短于正常的 UT-B 的 MRA 。缩短的长度与实验中设计基因打靶载体所去除的那部分长度等同。所以，在 MRA 水平，基因打靶的产物是正确的。
然后用 Western blot 来看其蛋白表达情况，见上图。可以看出，野生型和杂合子小鼠都有正常的尿素通道蛋白 UT-B 的表达。基因敲除的纯合子小鼠，没有 UT-B 蛋白的表达。从免疫染色的实验结果来看，正常野生型小鼠 UT-B 是在肾脏的支小血管膜上表达。在基因敲除小鼠的纯合子没有 UT-B 蛋白的表达。所以，基因敲除模型是成功的。
正常的小鼠，尿浓缩能力非常强。其尿的渗透压可以达到两千左右。如果进行禁水处理，禁水 18 小时后，其尿的浓缩能力，可以提高。这时尿的渗透压可以达到 3500 毫渗。
但是当把尿素通道 UT-B 基因敲除后，见上图。在正常的条件下，尿的渗透压只是 150 毫渗。即使18 个小时禁水处理，尿的渗透压也仅仅可以达到 2000-2500 左右。明显地低于正常的野生型小鼠。所以，就证明 UT-B 在尿浓缩过程中起非常重要的作用。从这个角度来看，这个基因的蛋白敲除是成功的。
五、基因敲入
基因敲入是通过基因打靶用突变基因置换正常基因，来表达异常蛋白。主要用于模拟人类遗传病模型。如 AQP2 突变基因敲入小鼠模型。
水通道蛋白 2（AQP2），正常情况下是在肾脏、集合管主细胞的顶膜表达。经过多年研究，发现该蛋白存在很
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多突变。当该蛋白基因出现突变，该蛋白就失去了正常的功能，而引起人类的尿崩症。在临床上的尿崩症有一部分是由于 AQP2 的基因突变造成的。为了研究 AQP2 基因突变所产生尿崩症的发病机制，并且能够治疗 AQP2 突变引起尿崩症的药物，建立了 AQP2 基因突变小鼠，用基因敲入的方式来进行。右图，表现的是 AQP2 突变型 T126M ，这个突变型的基因打靶载体。如上图所示，首先获得 AQP2 的详细基因序列，然后把第 126 位 T 的遗传密码，找到。然后在体外进行点突变的处理。这个点突变，是在 AQP2 的外因子2 的里边，然后把该点突变上游和下游的序列，分别作为基因打靶的长臂和短臂。然后在水通道 AQP2 ，的内含子 2 的里边，插入抗性基因，即青霉素抗性基因。然后自行制备出打靶载体，然后去重组置换正常的水平 AQP2 的基因序列。然后获得了基因敲入小鼠。对该基因敲入小鼠所产生的 AQP2 的 MRNA 和蛋白，进行了检测。水通道蛋白2（AQP2）的作用是（）A. 在肾脏、集合管主细胞的顶膜B. 促进肾脏对水的重吸收C. 该基因突变会引起尿崩症D. 以上都对正确答案：D解析：水通道蛋白2（AQP2），正常情况下是在肾脏、集合管主细胞的顶膜表达。当该蛋白基因出现突变，该蛋白就失去了正常的功能，而引起人类的尿崩症。在临床上的尿崩症有一部分是由于AQP2的基因突变造成的。9如上图所示，通过 Western blot检测发现 AQP2 mRNA ，在基因打靶后，产生突变的 AQP2 T126M 突变型的 mRNA ，在长度上与正常的 AQP2的 mRNA 一样。但是，其表达水平，却显著性增高。因为AQP2 是降压素调控的蛋白。当机体需要进行水吸收的过程中，需要 AQP2 高水平的表达，增加肾集合管对水的通透性，然后进行水的吸收。但是，当突变的 AQP2 表达后，不能正常地行使 AQP2 的功能，所以，不能进行水的重吸收。会产生脱水的症状，机体会反馈增加加速的水平，来调控 AQP2 的表达。通过反馈增加了突变的 AQP2 的 mRNA 的水平。从右图的 Western blot 结果可以看出，突变的 AQP2 蛋白迁移的位置与正常的野生型小鼠不同。通过糖的裂解分析，发现是由于异常的糖化所造成的。
如上图所示，由于 AQP2 的功能缺失，在进行尿浓缩能力实验时发现，在 AQP2 基因突变后，尿的渗透压明显低于正常野生型小鼠，表明其尿浓缩功能出现了缺失。通过对血的渗透压检测发现血的渗透压，明显升高，表现了严重的脱水征象。
右图的照片，表现的是正常的野生型小鼠、杂合子小鼠和突变基因敲入的小鼠，可以看出由于突变的小鼠出现了明显的尿崩症的症状，所以发育迟缓，并且一般死于一周内。由于出现了这一症状，这类小鼠是很难作为模型来研究 AQP42 在尿崩症中发病的机制，也很难用它来作为筛选新药的模型去寻找治疗 AQP42 突变的药物。所以，又设计了建立条件基因敲除小鼠。
六、条件基因敲除小鼠。
Cre 是重组酶，LoxP 是一段含有 34 个碱基的 DNA 序列。Cre 重组酶可以识别 LoxP 序列，通过DNA 重组的原理，可以将两个 LoxP 序列之间的片断，即 DNA 片断去除。如果是没有 Cre ， LoxP 只是
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在特定的基因片段两侧，不影响基因片段的活性。一旦 Cre 酶有活性，就可以把 LoxP 中间所夹的序列去除，这就是条件基因敲除制备的方法。右图是LoxP 位点。
上图是条件基因敲除的载体。在正常的基因敲除载体，长臂和短臂之间放上了 LoxP 序列。中间把原来正常的基因序列，还按照正常的顺序放到里面。当重组酶出现的情况下，就可以识别 Loxp 的位点，把LoxP 中间夹的片段给去除。
上图是所设计和构建的水平通道蛋白 AQP2 的基因条件敲除的载体。可以看出，该载体与前面的基因敲入载体很类似。只不过是在外显子 -2 中，没有突变位点。然后在外显子 -2 两侧，加入了两个 LoxP序列，通过基因打靶可以把带有 Loxp 序列，置换到正常的 AQP2 的基因部位所产生的基因打靶结果。在诱导 Cre 活性出现的时候， LoxP 两侧的中间夹的外显子 -2 被去除掉。这样就可以产生条件的敲除。
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经过条件敲除制备的小鼠。在 AQP2 在 mRNA 水平和蛋白质水平的表达情况，见上图。野生型小鼠在肾脏和睾丸等器官表达有AQP2的mRNA ，但是进行诱导敲除的小鼠，在组织器官没有明显的 AQP2 的 mRNA表达。从逆转录 PCR 即 RT-PCR ，也可以断定，没有 AQP2 的 mRNA 的表达。然后 Western blot 技术，来鉴定蛋白质的表达水平，可以看出，条件敲除后 AQP2 不能在小鼠进行正常的表达。
上图是免疫染色的结果，可以看出，正常的野生型小鼠 AQP2 蛋白，在集合管的主细胞顶膜表达，当进行条件敲除后， 95%-98% 的集合管上皮细胞都没有 AQP2 的表达，只是个别的细胞存在 AQP2 的表达。敲除率可以达到 95% 或者到 98% ，基本上是成功的。
由上图可的功能性鉴定可以看出，当 AQP2 的基因，没有进行条件敲除时，尿的渗透压大概是 2000mOsm 左右，这一条曲线，虚线是表示野生型的小鼠，实线是表现出 AQP2 条件敲除的小鼠，在前几天，是没有进行诱导敲除的情况下，其尿的渗透压和正常野生型小鼠非常接近的。当给诱导物注入后，由于Cre 活性的出现， AQP2 被敲除。可以看出，基因条件敲除之后，小鼠尿的渗透压明显地降低了，由2000 mOsm 降低到 200 mOsm 左右。尿量，在没有进行条件敲除时，小鼠的尿量和野生型小鼠是一样的，大概都是每 24 小时可以分泌 2ml 左右。但是当 AQP2 的基因被条件敲除后，尿量明显增加，可以达到25ml ，25ml/24h ，甚至尿量可以高于其体重。
七、条件敲入小鼠
有了 AQP2 突变敲入的小鼠，也有了 AQP2 的条件敲除小鼠，用这两个小鼠模型，就可以来建立AQP2 突变条件敲入小鼠。
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上图是建立 AQP2 突变条件敲入小鼠的模式图。可以把 AQP2 的突变杂合子小鼠，不能使用纯合子，因为纯合子到一周就会死掉。杂合子小鼠和 AQP2 条件敲除小鼠进行交配，得到一条染色体带有 AQP2 的突变基因，一条染色体带有 AQP2 条件敲除的基因，这也是一个杂合子。在需要的时候呢，可以诱导小鼠体内的 Cre 重组酶的活性，将条件敲除 AQP2 的基因诱导敲除。只剩下 AQP2 的突变基因还在等位基因位点，所以表达出来的蛋白产物应该是 AQP2 的突变蛋白产物，而不表达正常的 AQP2 的蛋白产物。
上图是 AQP2 突变敲入的这个小鼠鉴定的示意图。可以推断 Western blot 结果，所获得的带型，哪一条带是条件敲除，哪一条带是条件敲入的鉴定。
基因组 PCR 的手段来鉴定 AQP2 的效率，因为杂合子有一条染色体含有 AQP2条件敲除的基因，一条染色体带有 AQP2 突变的基因，需要 AQP2 进行敲除。诱导性条件敲除能敲除多大 的效率呢？通过 PCR 来鉴定，结果表明，经过敲除后，基因组
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中所含有正常的这个野生型的 AQP2 的基因，只有 5% 以下。所以，说明条件敲除是成功的。通过小鼠模型，其肾脏的蛋白检测，发现通过 Western blot 所检测的蛋白( 见右图 ) ，在条件敲入小鼠 AQP2 基因突变条件敲入小鼠， AQP2 的蛋白长度呢，与正常比是不一样的。这个长度与一开始所做的那种基因敲入小鼠所产生的突变AQP2 的蛋白，在长度和特异性上是一样的。所以 AQP2 条件敲入的这个模型，也是成功的。
上图表现了正常的野生型的 AQP2 蛋白在肾集合管顶膜的表达。在突变条件敲入的小鼠，我突变的AQP2 ，都是在集合管主细胞的细胞内，后来确定在内质网中表达，只有个别的细胞 AQP2 才在集合管顶细胞的膜表达，这个表达的细胞，实际表达的是条件敲除，没有敲除的是个别的细胞。条件敲除可能可以敲除 95% - 98% ，剩下 3-5% 的细胞仍然还可以表达正常的 AQP2 ，是表达正常的一部分。
同样对敲除后的肾功能、尿浓缩机制也进行了检测，见右图。发现条件敲入小鼠在诱导正常 AQP2 敲除的过程中，尿的渗透压明显降低。虽然还要略微高于纯粹的条件敲除， AQP2 条件敲除的小鼠，但是与野生型小鼠比较，尿的渗透压明显降低。说明小鼠模型建立是成功的。
通过检测尿浓缩能力来证实 AQP2 突变蛋白影响到尿浓缩能力，见下图。
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因为小鼠模型建立过程中，其设计和整个实验过程啊都与科研的目的、思路有直接关系，希望大家在建立转基因小鼠模型之前，对这个整个的基因的特性和蛋白的特性，包括实验目的要有统筹的想法，进行合理的设计，最后需要一年以上的时间来制备模型，一旦设计方面出现了问题，重新来做的话，可能在时间和财力、人力方面都是非常大的浪费。转基因小鼠模型，主要是通过阻止、改变或增加特定基因在小鼠体内的表达，来研究基因结构与功能，建立人类疾病的动物模型，研究各种药物的作用机制及药效学，并且可以生产生物活性药品，如人类血液因子等重要蛋白质来治疗某些疾病。 15
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