科研立项计划书

项目编号

北京林业大学

国家级大学生创新创业训练计划

创新训练项目申请书

项目名称： 主 持 人： 联系电话： 指导教师： 起止年月： 申请日期：

王君

栓皮栎组培再生体系的构建及原生质体游离研究 宋少宇

专业年级

生科10

职 称

副教授

学 院

生物科学与技术学院

2012年1月—2013年12月

2012年4月20日

北京林业大学

一、项目基本情况

项目名称 项目简介 栓皮栎组培再生体系的构建及原生质体游离研究 项目类别 申请经费 （元） 姓 名 √理工农类 □经管文法类 30000 起止年月 2012年1月——2013年12月 主持人 性别 学号 专业年级 联系电话 电子邮箱 宋少宇 女 7 生科 姓名 性别 学号 专业年级 所在学院 生物科学与技术学院 生物科学与技术学院 林学院 生物科学与技术学院 职务 项目分工 组培再生体系研究 组培再生体系研究 原生质体游离研究 原生质体游离研究 所在学院 生物科学与技术学院 项目组其他成员 李昌磊 男 3 生技10-2 曾青青 女 6 生科10 郭 倩 女 8 林学10-1 尚峰男 男 4 生科10 姓名 性别 年龄 职称 指导教师 王君 男 30 副教授 研究方向 林木倍性育种及细胞遗传学 联系电话 二、项目立项依据

（一）项目研究意义（限300字） 栓皮栎（Quercus varibilis）属壳斗科（Fagaceae）栎属（Quercus），树干通直，木材坚硬，抗腐蚀性强，树皮、果实及叶片等均有重要经济价值，是重要的硬阔用材和软木资源树种；同时，其分布广泛、适应性强，在维持地域生态平衡和生态系统恢复等方面具有重要作用。 然而，由于生长缓慢、控制授粉和无性繁殖困难，栓皮栎遗传改良研究相对滞后，主要集中在优树选择、种子园营建等方面，进一步加强栓皮栎遗传改良研究迫在眉睫。本项目以栓皮栎实生苗茎段为外植体，诱导愈伤组织并分化，构建再生体系；并在此基础上，分别以无菌苗叶片和愈伤组织为材料，研究原生质体游离条件，建立栓皮栎叶肉和愈伤组织原生质体游离技术体系，为进一步开展栓皮栎细胞工程途径遗传改良奠定基础。 （二）国、内外研究现状和发展动态，并附主要参考文献（限1000字） 植物原生质体为植物育种基础研究和遗传工程提供了一个方便的遗传操作实验系统。利用原生质体可以进行细胞融合和体细胞杂交，是一种创造远源杂种，获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体的新途径（Puite, 1992; Zeng et al., 2006）；原生质体又是植物基因工程的理想受体，可对外源基因、DNA片断、细胞器、染色体捕获创造一种新方法（Prols et al., 1988; Puite, 1992）。因此，开展植物原生质体游离、培养和细胞融合研究有重要的理论和实践意义。加强栎树原生质体游离与培养研究有望从细胞工程途径取得栎树遗传改良研究的突破。 植物原生质体游离最常用的方法是酶解法。用酶液分离原生质体，与起始材料、酶解时间、酶液成分和浓度等有密切关系。原生质体游离的起始材料通常采用由外植体诱导产生的愈伤组织、悬浮细胞、组织培养再生植株以及种子无菌萌发而来的叶片等。 常用于木本植物原生质体分离的酶类有纤维素酶（Cellulase R-10，Cellulase Rs）、果胶酶（Pectolase Y-23）、离析酶（Maerozyme R-10）、半纤维素酶（Hemicellulase）、崩溃酶（Driselase）等。不同植物，甚至同种植物的不同起始材料使用的酶的种类和浓度不尽相同。在山杏原生质体分离时添加%半纤维素酶可明显提高原生质体产量，而山桃原生质体分离时加入%半纤维素酶则对原生质体产量无影响（马锋旺和李嘉瑞，1998，1999）。酶解处理所遵循的原则是利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间获得大量有活力的原生质体(谢从华和柳俊，2004)。 原生质体分离时要求酶液和材料的比例合适才能有效分离原生质体。一般叶片、子叶需要量少，胚性愈伤组织和悬浮细胞需要量稍大，每克材料用酶量在10-20mL。酶解时间长短与材料和酶液的种类和浓度有关。酶解时间太短，酶解不充分，原生质体产量低;酶解时间太长，酶液会对原生质体产生毒性，原生质体有自溶现象，降低产量和活力(何业华等，1999)。光照可能损伤刚分离的原生质体质膜，造成原生质体活力下降（谢从华和柳俊，2004），因此酶解过程通常在黑暗或弱光条件下进行。同时，酶解时辅以低速振荡能有效提高原生质体产量。在桃原生质体分离中，30-50rpm低速振荡酶解的原生质体产量是静置酶解的几倍(Mills et al., 1994)。 同时，为了保持原生质体的活力和膜的稳定性，酶液中常加入甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等糖类物质作为稳定剂来调节渗透压。稳定剂的使用浓度因植物材料的不同而异，一般为（朱至清，2003）。原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定，较高水平的渗透压可以有效抑制原生质体的破裂和出芽，但也可能影响原生质体的分裂。 目前有关栎属树种原生质体游离的研究较少，仅国外学者在美国红栎（Quercus rubra）、枹栎（Quercus serrata）等树种中有所报道，且原生质体主要来源于根器官和胚胎发生细胞系（Brison and Lamant, 1990; Sasamoto and Hosoi, 1992），相关研究亟待深入。 参考文献 [1] Brison M, Lamant A. Callus formation from root protoplasts of Quercus rubra L. (red oak). Plant Cell Rep., 1990, 9(3): 139-142. [2] Mills D, Hammerschlag FA. Isolation of cells and protoplasts from leaves of in vitro propagated Peach (Prunus persica) plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1994, 36: 99-105. [3] Prols M, Topfer R, Schell J, Steinbib H. Transient gene expression in tobacco protoplasts: I. Time course of CAT appearance. Plant Cell Rep., 1988, 7:221-224. [4] Puite KJ. Progress in plant protoplast research. Physiol. Plant, 1992, 85(2): 403-410. [5] Sasamoto H, Hosoi Y. Callus proliferation from the protoplasts of embryogenic cells of Quercus serrata. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1992, 29(3): 241-245. [6] Zeng SH, Chen CW, Hong L, Liu JH, Deng XX. In vitro induction, regeneration and analysis of autotetraploids derived from protoplasts and callus treated with colchicine in Citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2006. 87(1): 85-93. [7] 何业华, 胡芳名, 谢碧霞, 胡中沂, 何钢. 枣树原生质体分离条件的研究. 中南林学院学报, 1999, 19(l): 20-23. [8] 马锋旺, 李嘉瑞. 山桃原生质体培养再生愈伤组织. 山西农业学报, 1999, 8(3): 73-76. [9] 马锋旺, 李嘉瑞. 山杏原生质体培养再生植株. 园艺学报, 1998, 25(3): 224-229. [10] 谢从华, 柳俊. 植物细胞工程. 北京:高等教育出版社, 2004. [11] 朱至清. 植物细胞工程. 北京:化学工业出版社, 2003. 三、项目研究内容

（一）项目研究内容（限600字） 1、栓皮栎愈伤组织的诱导和继代研究 分别以栓皮栎无菌茎段、叶片和叶柄为材料，对愈伤组织诱导培养基的外源生长调节剂种类及配比进行筛选，诱导产生愈伤组织，并筛选适宜的愈伤组织继代培养基和培养条件。 2、栓皮栎愈伤分化及植株再生研究 以栓皮栎愈伤组织为材料，筛选愈伤组织分化出芽的适宜培养基及其外源生长调节剂配比，并进一步开展生根适宜培养基的筛选，建立栓皮栎植株组培再生技术体系。 3、栓皮栎叶肉和愈伤组织原生质体游离研究 以栓皮栎无菌苗叶片和愈伤组织为材料，开展栓皮栎叶肉原生质体和愈伤组织原生质体游离的适宜预处理条件、酶种组合和适宜浓度、等渗剂浓度及酶解时间等相关技术条件研究，建立较为完善的栓皮栎原生质体游离技术体系。 （二）项目研究拟解决的关键问题（限300字） 1、 栓皮栎植株组培再生技术 栎树无性繁殖困难，主要采用种子园技术生产良种，难以同时利用对优良个体的加性和非加性效应，本研究通过建立栓皮栎无菌体系和植株再生系统，解决无性繁殖技术关键问题的同时，为进一步开展体胚发生和基因工程育种研究奠定基础。 2、 栓皮栎叶肉及愈伤组织原生质体游离技术 利用原生质体可以进行细胞融合和体细胞杂交，是一种创造远源杂种，获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体的新途径。本研究解决栓皮栎原生质体游离关键技术，建立栓皮栎原生质体游离技术体系，为进一步开展原生质体培养，实现细胞工程育种突破奠定基础。 四、项目实施方案

（一）项目研究拟采取的研究方法、技术路线、实验方案（限1000字） 1、研究方案和技术路线 本项目以栓皮栎无菌茎段、叶片、叶柄等为材料，诱导产生愈伤组织，并通过筛选培养基诱导愈伤组织分化为芽和根，构建再生体系；在此基础之上，以无菌苗叶片和愈伤组织为材料，探索原生质体游离条件，形成较为完善的栓皮栎原生质体游离技术体系。 技术路线如下： 栓皮栎茎段外植体 消毒、灭菌、接种 无菌体系 无菌茎段、叶片、叶柄 无菌叶片和愈伤组织 愈伤组织诱导适宜培养基筛选 愈伤组织继代适宜培养基筛选 适宜预适宜酶适宜等适宜酶处理技种及浓渗剂浓解时间术研究 度筛选 度筛选 研究 愈伤组织分化出芽培养基筛选 生根培养基筛选 栓皮栎植株再生体系建立 2、研究方法 （1）栓皮栎外植体的接种和继代培养 栓皮栎原生质体游离技术体系 采集栓皮栎枝条水培，抽条后，切取含腋芽的幼嫩茎段做为外植体，依次经滴露表面消毒5min，自来水冲洗30min，70%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，%HgCl2浸泡处理2min，无菌水冲洗3次的消毒过程后接入MS(Murashige和skoog，1962）附带6-BA L的初始培养基。接种后每20至30天转接一次，继代培养基为MS附带6-BA L，扩大无菌材料数量。 （2）栓皮栎愈伤组织的诱导 采用正交试验设计，分别以栓皮栎无菌茎段、叶片和叶柄为材料，进行愈伤组织诱导培养基适宜激素种类及配比的筛选，以MS作为基本培养基，筛选因素包括细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度及配比，L9（3）正交试验设计表如下： 表2 愈伤组织诱导培养基激素组合及浓度水平 Element -16-BA (mg·L) Level 1 2 3 （3）栓皮栎愈伤组织分化及植株再生 以栓皮栎愈伤组织为材料，采用L9（3）正交实验设计，以MS为基本培养基对愈伤组织分化为芽的培养激素配比进行筛选，试验设计如下： 表3 愈伤组织分化培养基激素筛选试验设计表 Element Level 1 2 3 6-BA (mg·L) 0 -144NAA (mg·L) 0 -12，4-D (mg·L) 0 -1TDZ (mg·L) 0 -10 NAA (mg·L) 0 -12,4-D (mg·L) 0 -1TDZ (mg·L) 0 -1将愈伤组织分化形成的芽转移到生根培养基中，以MS培养基为基本培养基对生根培养基激素配比进行筛选，设计如下： 表4 生根培养基激素筛选试验设计表 Element Level 1 2 3 4 6-BA (mg·L) 0 -1NAA (mg·L) 0 -1 （4）栓皮栎叶肉和愈伤组织原生质体的游离 分别以栓皮栎无菌苗叶片和愈伤组织为材料，以正交实验设计结合单因素实验设计，采用酶解法，研究酶的种类与浓度、渗透压稳定剂浓度、酶解时间、预处理方法等因素对原生质体分离效果的影响。将叶片或愈伤组织切成 mm的细条或者碎块，按照1:10的比例置于经抽滤灭菌的含纤维素酶R-10、半纤维素酶、果胶酶Y-23和离析酶R-10的混合酶液中，在一定的温度下、慢速往复式摇床上黑暗酶解。酶液为CPW盐溶液加一定浓度的甘露醇，并附加MES g/L、BSA 1 g/L，pH为。酶解产物分别经200目和400目不锈钢滤网依次过滤，以除去未酶解完全的细胞团或组织，500 r/min 离心 min 收集，新鲜洗液洗涤3次，收集原生质体。 4表5 原生质体分离酶种及浓度筛选L9(3)正交实验设计表 Element Cellulase R-10 Hemicellulase Pectinase Y-23 Level 1 2 3 0 % 3% 0 % % 0 % % MacerozymeR-10 0 % % （5）原生质体的产量与活力测定 用血球计数板统计原生质体产量，每个样品计数重复5次，取平均值，最后计算原生质体产量。 原生质体数（个/mL）=5个大格内原生质体总数×5×10000×稀释倍数； 原生质体产量（个/g）=[原生质体数（个/mL）×稀释后体积（mL）]/叶片总质量（g）； 原生质体产量遵从泊松分布，应该对获得的原生质体产量试验数据进行平方根转换后，应用Microsoft Excel软件进行统计分析。 原生质体活力测定用%二乙酸荧光素（FDA）染色。每个样品观测5 次取平均值，统计原生质体活力。 原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数/原生质体总数)×100%。 （6）数据处理 主要采用方差分析对数据处理进行处理，其中涉及百分率的数据在方差处理前进行反正弦平方根转换。 （二）项目实施年度计划 二〇① 2012年1～4月，采集栓皮栎外植体，接种获得无菌苗； 一② 2012年5～10月，栓皮栎愈伤组织诱导研究； 二③ 2012年11～12月，数据整理。 年 二〇一三年 ① 2013年1～4月，栓皮栎叶肉原生质体的游离技术研究； ② 2013年2～7月，栓皮栎愈伤组织分化及植株再生研究； ③ 2013年6～10月，栓皮栎愈伤组织原生质体游离技术研究； ④ 2013年11～12月，整理试验结果，撰写研究论文和总结报告。 二〇一 四年

五、项目研究基础

（一）与本项目有关的研究积累和已取得的成绩（限300字） 本项目申请者及项目组成员均为生物学院生物科学和生物技术专业10级学生，已主修了《植物学》、《植物组织培养》等相关专业基础课程，通过查阅文献资料进一步学习，对植物生物技术研究有了较为全面的认识，且项目组成员已开展植物组织培养相关研究较长时间，较为熟练的掌握了基本操作技能。指导教师及其课题组长期从事林木遗传改良研究，在新疆杨等杨属树种中已系统开展组织培养及原生质体游离与纯化方面研究，发表学术论文一篇，具有丰富的研究经验和知识储备。 该项目前期试验已有所开展，已通过接种栓皮栎外植体获得了无菌材料，为本项目的进一步实施奠定了基础。目前正在进一步扩繁栓皮栎茎段。 （二）已具备的研究条件、设备条件等（限200字） 本项目依托北京林业大学林木育种国家工程实验室和林木花卉遗传育种教育部重点实验室，相关试验主要在北京林业大学分析测试中心生物技术室开展，实验室有关植物组织培养、原生质体游离、显微观察等试验条件和设备较为完善，可基本满足项目研究需求。 （三）尚缺少的条件及解决方法（限200字） 本项目试验条件尚缺少1000μL和200μL微量移液器各1把用于培养基的配制和原生质体的游离、国产大容量低速离心机1台用于原生质体的收集，拟通过购置的方式解决。 六、项目特色、创新点及预期成果

（一）项目的特色与创新点（限300字） 1、研究思路科学：本项目基于栓皮栎无菌再生体系研究，分别利用研究过程中获得的无菌叶片和愈伤组织开展原生质体游离技术探索，步步深入，思路科学。 2、研究材料重要：栓皮栎木材坚硬，抗腐蚀性强，是重要的硬阔用材和软木资源树种；其分布广泛、适应性强，在维持地域生态平衡和生态系统恢复等方面具有作用巨大。 3、研究方法新颖：植物原生质体为植物育种和遗传工程研究提供了理想的遗传操作实验系统。本项目在国内首次开展栎树原生质体游离技术研究，有望从细胞工程途径突破栎树遗传改良研究进展。 4、理论联系实际：栓皮栎无性繁殖困难，遗传改良程度低，本项目的实施有望从组培快繁途径实现无性繁殖，并为进一步开展细胞工程育种奠定基础。 （二）项目预期成果及成果提交方式（限300字） 1、 构建并优化栓皮栎组培再生体系； 2、 建立较为完善的栓皮栎原生质体游离技术体系； 3、 提交北京林业大学国家级大学生创新训练计划项目结题报告； 4、 发表中文核心期刊论文1篇； 5、 申请国家发明专利1项； 6、 熟练掌握植物组织培养及原生质体分离实验技能，提高个人独立设计并完成试验的能力，以及共同面对问题、解决问题的团队合作精神。 七、项目经费预算

支出科目 合计 预算金额 （元） 预算编制依据 主要用途 1.材料费 18100 ①纤维素酶20g，单价70元/g，总价1400元； ②果胶酶10g，单价900元/g，总价9000元； ③半纤维素酶10g，单价340元/g，总价3400元； ④离析酶10g，单价80元/g，总价800元； ⑤甘露醇等稳定剂2100元； ⑥配制培养基所需的基本物质等试剂和离心管、枪头、培养皿等耗材共1400元。 微量移液器2把，单价1450元/把，合计1450×2=2900元 ①中文核心期刊论文1篇，版面费约2000元； ②国家发明专利申请代理费用2500元； ③文献资料的检索、复印、报告印制等费用约500元 用于购置原生质体游离所需酶类、稳定剂，配制培养基所需的基本物质等试剂，以及离心管、枪头、培养皿等耗材 2.设备费 （1）购置设备费 （2）试制设备费 （3）改造设备费 （4）设备租赁费 3.测试化验加工费 购置微量移液器2把 4.出版/文献/信息传播/知识产权事务费 用于文献资料的检索和论文发表版面费 5.差旅费 ①采集栎树试验材料的来回差旅费约1500元/人，2人共3000元； 用于试验材料的采集和②来回于位于北京顺义育苗基地调查的差旅交通费用 的市内交通费1000元 6.会议费 7.其他支出 八、项目执行承诺

主持人签名： 项目组其他成员签名： 日 期： 九、项目审批意见

（一）指导教师意见及承诺（手写） 签字： 日期： （二）学院意见 主管领导签字（公章）： 日期： （三）学校意见 负责人签字（公章）： 申请书请用A4纸双面打印，于左侧装订成册。 日期：