纳豆芽孢杆菌液体发酵生产_聚谷氨酸(1)

纳豆芽孢杆菌液体发酵生产γ-聚谷氨酸

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刘常金，郑焕兰，姜川，杨婷，赵琤

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，泰达BIO-X系统生物技术研究中心，天津 300457）

（2.天津城市建设学院环境与市政工程系，天津 300384）

摘要：本研究采用单因素实验和正交实验优化了纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）液体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵培养基和发酵条件。结果表明，在25 g/L葡萄糖为碳源，15 g/L蛋白胨为氮源，谷氨酸钠添加量20 g/L的基础上，纳豆杆菌在pH为7.5，接种量为2%，摇床转速为150r/min, 装液量为50mL/250mL三角瓶的条件下液体发酵48 h，发酵液的γ-PGA产量达到11.97 g/L。产物水解后，经液相色谱检验，初步确定产物为γ-聚谷氨酸。利用SDS一PAGE电泳对发酵产物的分子量进行了测定，结果表明其并非是单一分子量的γ-PGA，而是多种不同分子量的混合体。

关键词：纳豆芽孢杆菌；液体发酵；γ-聚谷氨酸；HPLC；SDS-PAGE 中图分类号：Q814.1；文献标识码：B；文章篇号:1673-9078(2009)08-0935-05

Production of γ-Poly Glutamic acid via Liquid Fermentation by Bacillus subtilis natto

LIU Chang-jin1, ZHENG Huan-lan1, JIANG Chuan2, YANG Ting1, ZHAO Cheng1

（1.TEDA BIO-X Center for Systems Biotechnology, College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457,China）（2.Department of Environmental and Municipal Engineering, Tianjin

Institute of Urban Construction, Tianjin 300384, China）

Abstract: The optimum liquid fermentation technology of γ-Poly Glutamic acid（）produced by Bacillus subtilis natto was obtained through single factor and orthogonal experiments. The results showed that the yield of was 11.97g/L under the following optimum conditions: glucose content 2.5%, peptone content 1.5%, monosodium glutamate content 2%, pH 7.5, fermentation time 48 hours, the shaking speed 150 rpm and sample volume 50 mL in 250 mL shaking flask. The hydrolysate of the product was analyzed by HPLC and determined as γ-PGA. SDS-PAGE showed that the hydolysate was the mixture of γ-PGA with different molecular weights.

Key words: Bacillus subtilis natto; Liquid femertation;γ-Poly Glutamic acid;HPLC; SDS-PAGE

γ-多聚谷氨酸[Poly-γ-glutmic acid，γ-PGA]是一种高分子氨基酸聚合物，最早于1913年在炭疽芽孢杆菌的细胞荚膜中发现。多聚谷氨酸(以下简称γ-PGA)是由L-谷氨酸和L-谷氨酸或D-谷氨酸单体之间通过α氨基和γ羧基形成肽键之后生成的聚酰胺[1,2,3]，其分子式如下：

纯化及其结构初步分析。 1 材料与方法

1.1 菌株

纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）（本实验室保存，从日本纳豆中分离得到）。 1.2 试剂

所用试剂为均为国产或进口分析纯。 1.3 培养基

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母提取物5，琼脂粉20，pH 7.0。

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母提取物5。

发酵基础培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，谷

NaH2PO4 1，MgSO4 0.5，pH 7.0。 氨酸钠20，Na2HPO4 1，

1.4 液体种子制备及摇瓶培养

作为一种高分子量的聚合物，γ-PGA的分子链上有大量游离羧基，使其具有一般聚羧酸的性质，因此其有很强的吸水性。此外γ-PGA还具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶和黏接等功能[4,5]。本文对用纳豆杆菌液体发酵生产γ-PGA的发酵条件的优化，分离

收稿日期：2009-04-02

作者简介：刘常金，食品工程与生物技术学院生物技术系主任

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将斜面生长的菌种用接种环接入到含50 mL种子培养基的250 mL的三角瓶中，摇床转速为120 r/min，37 ℃培养20 h后在以一定接种量接入到不同组成的发酵培养基中振荡培养。 1.5 发酵液黏度的确定

将发酵液离心去除菌体后，用NDJ-79型旋转式黏度计检测发酵液的黏度值。同样，将提取物用一定量蒸馏水稀释后检测黏度。黏度单位为mPa⋅s。 1.6 γ-PGA产量的确定

称重法。

1.7 生物量测定方法[6]

分光光度测定法。 1.8 分析方法

1.8.1 培养条件优化

首先采用单因素实验，初选各因素的合理范围。在此基础上，采用正交实验优化单因素实验。实验因素主要包括：发酵总时间、pH值、味精添加量、摇床转速和装液量等。

1.8.2 γ-PGA水解后的高效液相分析 1.8.2.1 水解条件

取0.02 g样品，放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl，通入氮气，维持10 min后封口。110 ℃水解24 h，冷却后移至10 mL容量瓶中。用超纯水洗涤3次，定容、过滤后取滤液分析氨基酸含量。 1.8.2.2 衍生方法

衍生剂：2,4-二硝基氟苯；衍生缓冲液：42 g/L Na2CO3；定容缓冲液：3.4 g KH2PO4加入到145.5 mL 0.1 mol/L NaOH，用水定溶至500mL。10 μL样品+150 μL衍生缓冲剂+150 μL衍生剂+690 μL定容缓冲液，混匀，60 ℃保温1 h，0.45 μm膜过滤后备用。

液相色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent TC-Cl8色谱柱(φ4.6 mm×250 mm)，流动相A：V(乙腈):V(水)=1:1，流动相B：NaAc-HAc (pH 6.4)，柱温：30 ℃，流速0.8 mL/min，紫外检测器，波长：200 nm，进样量20 μL。

1.8.3 发酵产物分子量的测定

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：Bio-Rad蛋白质电泳仪，10%分离胶，5%浓缩胶。0.1%的考马斯亮兰染色液染色1h，5%的甲醇和7%的冰醋酸与水混合液脱色过夜。 2 结果与分析

2.1 发酵条件对γ-PGA产量的影响 2.1.1 培养温度的确定

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在装液量50 mL/250 mL三角瓶、pH7.0、发酵时间48h、2%接种量、120 r/min振荡培养的条件下，考察培养温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃时对γ-PGA粗品产量的影响，结见图1。

图1 培养温度对γ-PGA产量的影响 Fig.1 Effect of temperature on yield of γ-PGA

如图1所示：纳豆菌在37℃的条件下，生物量和γ-PGA粗品的产量达到最高值，这说明在此温度下菌体生长过程中起作用的酶系和γ-PGA合成酶系活力都很高。故确定37℃为最适培养温度。 2.1.2 总发酵时间的确定

在2.1.1的基础上，考察不同发酵时间对γ-PGA粗品产量的影响。发酵结果见图2。

图2 总发酵时间对γ-PGA产量的影响

Fig.2 Effect of total fermentation time on yield of γ-PGA

如图2所示，发酵前48 h发酵粗提物产量不断增加，48h后提取物不断减少，说明48 h后发酵液中的菌体已经开始分解目标产物，所以实验取发酵48 h作为最佳发酵时间，进行γ-PGA的发酵生产。 2.1.3 初始pH的确定

在2.1.2的基础上,考察发酵基础培养不同pH值(3.0~11.0)对γ-PGA粗品产量的影响，结果见图3。

发酵过程中培养基pH接近中性，聚谷氨酸因侧链具有游离的羧基而带有负电荷，并作为菌株荚膜的主要成分分泌至胞外，因而菌体表面带负电荷，由于同性电荷相斥，菌体不易聚集，而稳定悬浮于发酵液中。同时γ-PGA具有较高的分子量，在胞外不断积累使发酵液具有很高的黏度，从图3的三次平行实验可知，纳豆菌在pH 7.5~8.5的范围内黏度最大，说明此

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pH范围内发酵液的黏性最高，发酵粗提物含量也相应最高。选择pH7.5为实验时的液体发酵pH值。

由图5可知，转速为150 r/min时，γ-PGA的产量最高，故确定150 r/min为最佳转速。 2.1.6 装液量的确定

在2.1.5 的基础上，考察250 mL三角瓶装液量分别为20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL时对γ-PGA产量的影响，结果见图6。

由图6可知，装液量为50 mL时，γ-PGA的产量最高，故确定实验最适装液量为50 mL/250mL三角瓶。

图3 初始pH对发酵液黏度的影响

Fig.3 Effect of initiative pH on fermentation viscosity

2.1.4 接种量的确定

在2.1.3的基础上，考察接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%时对γ-PGA产量的影响，见图4。

图6 装液量对γ-PGA产量的影响 Fig.6 Effect of loading amount on yield of γ-PGA

图4 接种量对γ-PGA产量的影响 Fig.4 Effect of inoculums size on yield of γ-PGA

2.2 培养基组成对γ-PGA产量的影响

2.2.1 碳源对γ-PGA产量的影响

在不改变发酵基础培养基其他条件的情况下，选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、柠檬酸、可溶性淀粉、甘油为不同碳源代替基础培养基中碳源进行发酵产酶试验，结果见图7。

由图4可知，接种量为2%时γ-PGA的产量最高，高于这个接种量则导致菌体生长过快、基质缺乏或溶氧不足而造成γ-PGA的产量下降；低于这个接种量由于发酵的适应期延长，同样造成γ-PGA的产量下降。故确定2%为最佳接种量。 2.1.5 摇床转速的确定

摇床转速可以在一定程度上控制溶解氧的水平。在2.1.4实验的基础上，考察摇床转速分别为0 r/min、70 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、200 r/min时对γ-PGA产量的影响，结果见图5。

图7 不同碳源对γ-PGA产量的影响 Fig.7 Effect of carbon source on yield of γ-PGA

图5 摇床转速对γ-PGA产量的影响 Fig.5 Effect of shaking speed on yield of γ-PGA

如图7所示，葡萄糖、蔗糖的发酵效果比其它碳源要好，而在这两种碳源中，葡萄糖的发酵效果比蔗糖的稍好，选择葡萄糖作为发酵生产的最佳碳源。 2.2.2 氮源对γ-PGA产量的影响

以葡萄糖为碳源，考察6种无机氮和3种有机氮分别做氮源时对γ-PGA产量的影响，结果如图8。从图8知，添加蛋白胨的菌体生长状况最好，发酵产物的产量最高，故确定其为最适宜的氮源。

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制γ-PGA产品。

表1 正交实验设计及实验结果 Table 1 Design and results of orthogonal test

No.

Glucose Peptone (g/L)

(g/L)

Monosodium glutamate(g/L)

20 25 30 25 30 20 30 20 25

Error item

γ-PGA(g/L)

1 15 10 1 10.71 2 11.00 3 10.21 3 10.97 1 9.18 2 10.05 2 9.15 3 11.97 10.96

图8不同氮源对γ-PGA产量的影响 Fig.8 Effect of nitrogen source on yield of γ-PGA

2 15 15 3 15 20 4 20 10 5 20 15 6 20 20 7 25 10 8 25 15 9 25 20 K1K2K3

10.64010.06710.693

10.27710.71710.407

2.2.3 不同葡萄糖、蛋白胨和谷氨酸钠浓度对γ-PGA产量的影响

根据营养需求的不同，可将γ-PGA生产菌分为两大类：谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖型。文献报道的生产实用菌一般都是谷氨酸依赖菌。如图9，在培养基中添加2.5%的-谷氨酸钠的γ-PGA产量明显高于未添加谷氨酸钠的对照组。单因素实验结果表明葡萄糖和蛋白胨的最佳添加量为2%和1.5%。

10.910 10.283 10.977 10.067 9.513 11.050 1.464

0.983

R 0.626 0.440

图9 三种因素不同浓度条件下的γ-PGA产量 Fig.9 Effects of concentrations of three factors on yield of

γ-PGA

图10 谷氨酸标准品的HPLC图

Fig.10 HPLC chromatogram of pure glutamic acid

2.4 发酵产物的HPLC分析

2.2.4 正交试验

根据单因素试验结果，选取培养基中葡萄糖、蛋白胨和谷氨酸钠这三个主要因素进行三水平正交试验(见表1)。从表1知，在选定的因素水平内，对液体发酵γ-PGA影响的主次顺序为：谷氨酸钠＞葡萄糖＞蛋白胨。8号试验组合γ-PGA产量最高，再结合单因素实验的结果，因此，确定该菌的最佳发酵工艺为：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，谷氨酸钠20g/L。 2.3 γ-PGA的分离提纯

液体发酵完后，发酵液在4000 r/min离心10 min，收集上清液，加3~4倍体积的预冷乙醇沉淀γ-PGA，4 ℃冰箱过夜，10000 r/min离心20 min，收集沉淀，冻干得到粗制品γ-PGA。

为了提纯γ-PGA，将乙醇沉淀的γ-PGA再溶于生理盐水中，经14000 Da透析除盐，再调pH到2~3进行等电沉淀，4 ℃下10000 r/min离心20 min，沉淀冻干得到精

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图11 发酵产物水解液的HPLC图

Fig.11 HPLC chromatogram of hydrolysate of fermentation

product

将γ-PGA水解后进行高效液相色谱分析。由图11发酵产物水解样品左侧第3个峰的出峰时间为6.10 min，与图10的L-谷氨酸标准品的出峰时间一致，可以表明水解产物是L-谷氨酸。右侧为衍生剂峰。 2.5 SDS-PAGA测定发酵产物的分子量

从图12可知，发酵产物不是单一分子量的γ-PGA，

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而是多种不同分子量的混合体。

γ-PGA产量达到11.97 g/L。产物水解后，经液相色谱检验，初步确定产物为γ-聚谷氨酸。利用SDS一PAGE电泳对发酵产物的分子量进行了测定，结果表明其并非是单一分子量的γ-PGA，而是多种不同分子量的混合体。可以把它降解到一定分子量的范围，以满足对γ-PGA不同应用产品的研究开发。

参考文献

[1] 桑莉,徐虹,李晖等.γ-聚谷氨酸产生菌的筛选及发酵条件[J].

过程工程学报.,2004年,4(5):462-466

[2] 王圣磊.产生γ-聚谷氨酸发酵的条件分析[J].齐鲁药事, 2006,

25(7):437-440

[3] Shih I L,Van Y T. The Production of Poly(γ-Glutamic Acid)

from Microorganism and Its Various Applications [J]. Bioresource Technology,2001,79:207−225

[4] 施庆珊,许虹,林小平,等.γ-聚谷氨酸的微生物合成[J].生物技

术,2004,14(1):65-67

图12 发酵产物的SDS一PAGA电泳

Fig.12 SDS-PAGE of fermentation product

3 结论

[5] Maria Borbely ,Yukio Nagasaki, Janos Borb. Biosynthesis and 本实验对纳豆杆菌生产γ-PGA的液体发酵工艺进

chemical modification of poly(γ-glutamic acid) Polymer[J]. 行优化。在25g/L葡萄糖为碳源，15g/L蛋白胨为氮源，

Bulletin,1994,32:127-132 谷氨酸钠添加量20g/L的基础上，纳豆杆菌在pH为7.5，

[6] 梁淑娃,黄晓曼,夏枫耿等.纳豆激酶液体深层发酵技术的研接种量为2%，摇床转速为150 r/min，装液量为

究[J].现代食品科技,2007,23(6):1-3 50mL/250mL三角瓶的条件下液体发酵48 h，发酵液的

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[11] NicolaVolpi, Francesca Maccari. Purification and

characterization of hyaluronic acid from the mollusc bivalve Mytilus galloprovincialis[J]. Biochimie,2003,85:619-625 [12] Mohamad Warda, Eman M. Gouda, Toshihiko Toid, et al.

Isolation andcharacterization of raw heparin from dromedary intestine: evaluation of a new source of pharmaceutical heparin[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2003, 136:357-365

[13] 林颖,黄琳娟,田庚元.一种改良的糖醛酸测定方法[J].中草

药,1999,30(11):817-819

[14] 郑震寰,尹鸿萍,叶波平,等.螺旋藻酸性多糖的电泳方法研

究,药物生物技术,2004,11(2):104-107

[15] ZHANG Ming-fang,CHEN Li-Ping,IRATA Yutaka,et al.

Rapid detection of specific proteins expressed in cytoplasmic male-sterile line of tuber mustard using SDS-PAGE[J].Journal

of Zhe jiang University,2001,27(6): 646-648

[16] 吕志华,赵峡,于广利,等.硫酸多糖电泳方法的研究[J],中国

生化药物杂志,2002,23(1):17-18

[17] 陈培榕,李景虹,邓勃.现代仪器分析实验与技术[M].北京:清

华大学出版社,2006:234-281

[18] Lauder R,Huckerby T,Nieduszynski. A fingerprinting method

for chondroitin demmtan sulphate and hyaluronan oligosaccharides[J]. Glycobiology,2000,10(4):393-401

[19] Linli Chi,Jonatban Amster,Robert J.Linhardt. Mass

Spectrometry for the Analysis of Highly Charged Carbohydrates[J].Current Analytical Chemistry,2005,1: 223- 240

[20] 赵瑶兴,孙祥玉.有机分子的结构光谱鉴定[M.北京:科学技

术出版社,2003

[21] 郭振楚.糖类化学[M].北京,化学工业出版社,2005

939