(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112362770 A(43)申请公布日 2021.02.12
(21)申请号 202011171723.X(22)申请日 2020.10.28
(71)申请人 上海药明康德新药开发有限公司
地址 201200 上海市浦东新区外高桥保税
区富特中路288号(72)发明人 胡艳君 俞召弟 黄浩辉 梁文忠
邓华妮 (74)专利代理机构 上海市汇业律师事务所
31325
代理人 王函(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)G01N 30/72(2006.01)G01N 30/04(2006.01)G01N 30/06(2006.01)
权利要求书2页 说明书6页 附图3页
G01N 30/14(2006.01)G01N 30/86(2006.01)G01N 30/88(2006.01)
CN 112362770 A(54)发明名称
一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法(57)摘要
本发明公开了一种利用高效液相串联质谱仪检测5‑氨基酮戊酸的方法。其利用不含有5‑氨基酮戊酸的替代基质，添加不同浓度的5‑氨基酮戊酸溶液配制成标准曲线；在真实空白基质中添加不同浓度的5‑氨基酮戊酸溶液配制成质控样品。在标准曲线和质控样品中添加稳定性同位素标记的内标后，对样品进行除蛋白和衍生化处理，然后用高效液相串联质谱仪测定，建立质谱
从而来推响应与5‑氨基酮戊酸浓度的线性关系，
算出未知浓度待测样品中5‑氨基酮戊酸的浓度。本发明解决了生物基质中内源性5‑氨基酮戊酸难以准确定量，干扰成分多，灵敏度低的问题，具有操作简单，灵敏度高，通量高与成本低的优点，能满足大批量生物基质样品中5‑氨基酮戊酸的浓度测定。
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权 利 要 求 书
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1.一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）5-氨基酮戊酸标准曲线和质控样品的配制：精密称量5-氨基酮戊酸的标准物质，用极性溶剂稀释配制成6-8个浓度梯度的标准曲线和4-5个浓度水平的质控样品工作溶液；将5-氨基酮戊酸标准曲线工作溶液按比例与替代基质混合，涡旋仪涡旋配制得到替代基质标准曲线样品；所述替代基质为不含有5-氨基酮戊酸标准物质；将5-氨基酮戊酸质控样品工作溶液按比例添加到真实空白基质中，涡旋仪混匀得到真实基质质控样品；低于真实空白基质中本底浓度的质控样品，由替代基质中加入质控工作溶液制备得到；（2）稳定性同位素内标工作溶液配制：
精密称量稳定性同位素标记的5-氨基酮戊酸标准物质，稀释配制成单一浓度的内标工作溶液；（3）样品除蛋白和衍生化处理：分别取混合好的标准曲线样品、真实基质质控样品、低于真实空白基质中本底浓度的质控样品、真实空白基质样品、未知浓度待测样品到容器中，加入步骤（2）制备的稳定性同位素内标工作溶液，涡旋混匀；对所有样品加入有机试剂，振摇后高速离心，取上清液用氮气吹干；每个样品中加入衍生化试剂，涡旋反应后离心，得待测样品；（4）高效液相串联质谱分离检测：用高效液相色谱系统对步骤（3）制备的样品进行分离，用质谱进行检测；（5）方法标准曲线建立和准确性确证：将步骤（4）采集的数据，用替代基质中5-氨基酮戊酸的浓度，与在高效液相色谱串联质谱上对应仪器响应进行拟合，所述对应仪器响应为5-氨基酮戊酸和内标峰面积比值，建立5-氨基酮戊酸浓度与仪器响应的标准曲线；根据真实空白基质样品和质控样品的仪器响应，代入标准曲线中回算浓度，并评价方法的准确度；（6）检测未知样品浓度：
将未知浓度待测样品的仪器响应值代入步骤（5）建立的标准曲线公式中，计算出未知浓度待测样品中5-氨基酮戊酸的浓度。
2.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）中5-氨基酮戊酸标准曲线和质控样品的配制，所述替代基质能模拟生物基质的溶液，用替代基质制备标准曲线；所述真实空白基质为生物液体基质，以及粪便和组织器官匀浆液，用真实空白基质制备质控样品，质控样品的浓度为添加的5-氨基酮戊酸与基质中本底浓度之和。
3.如权利要求2所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述生物液体基质为生物来源的全血或血清或血浆或尿液。
4.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）中极性溶剂为水。
5.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，5-氨基酮戊酸标准曲线工作溶液与替代基质混合的体积比大于或等于1:20；5-氨基酮戊酸质控样品工作溶液与真实空白基质的体积比大于或等于1:20。
6.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征
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权 利 要 求 书
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在于，所述步骤（3）中样品除蛋白和衍生化处理，所有样品加入有机试剂除去样品中的蛋白质，所得到的上清液吹干后与衍生化试剂进行反应，得到极性变小的衍生化合物；所述有机试剂为甲醇，所述衍生化试剂为正丁醇。
7.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤（4）中高效液相串联质谱分离检测，所使用的液相系统为反相液相体系，质谱为三重四极杆质谱检测器。
8.如权利要求7所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤（4）中高效液相串联质谱分离检测，其中色谱条件：色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH C18 Column, 300Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 100 mm；流动相组成：流动相A：含有0.1%甲酸的水溶液；流动相B：含有0.1%甲酸的甲醇溶液；质谱条件：待测物和内标的离子对分别是，188.1/114.1和191.1/55.1；喷雾电压：5500 v；离子源温度：500 ℃；加热辅助气：50 psi。
9.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤（5）中方法标准曲线建立和准确性确证，真实空白基质得到的仪器响应值代入标准曲线中回算，得到真实空白基质的本底浓度，结合加入的5-氨基酮戊酸的浓度计算出真实基质质控样品的理论浓度；仪器检测得到质控样品浓度与其理论浓度的偏差在±15%范围内，满足方法的准确度要求，能用于未知浓度待测样品的浓度检测；所述建立5-氨基酮戊酸浓度与仪器响应的标准曲线，该标准曲线的线性关系方程为：y=斜率*x+截距，其中x代表5-氨基酮戊酸在替代基质中的浓度，浓度范围为1.00-100 ng/mL，y代表所对应的仪器响应，所述对应的仪器响应为5-氨基酮戊酸与内标峰面积比值，截距是真实空白基质样品的仪器响应。
10.如权利要求1所述的一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法，其特征在于，所述步骤（2）中稳定性同位素内标工作溶液配制，5-氨基酮戊酸稳定性同位素内标为 13
C2,15N-5-氨基酮戊酸或者是13C3-5氨基酮戊酸及其所有盐形式。
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说 明 书
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一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法
技术领域
[0001]本发明属于检测的技术领域，具体涉及一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法。
背景技术
[0002]光敏剂的光动力学疗法（photodynamic therapy，PDT）是一种新颖的对肿瘤和炎症无创治疗方法，依靠特定波长光源照射激活肿瘤和炎症组织中的光敏剂，产生具有生物毒性的单态氧等活性氧物质，进而氧化损伤肿瘤，杀死细菌，真菌，消除炎症。5-氨基酮戊酸（5-ALA）为现阶段已知的光敏剂之一，在文献中广泛报道。
[0003]基于5-氨基酮戊酸的光动力疗法治疗皮肤病创伤小，成为治疗皮肤癌前病变，重度痤疮等皮肤疾病的一线治疗方案。自从2007年以来，在中国5-氨基酮戊酸光动力治疗痤疮被广泛使用，为2019年修订“中国痤疮治疗指南”中的共识推荐。5-氨基酮戊酸光动力疗法临床安全有效、毒副作用轻，初步临床试验显示其用于治疗痤疮，尤其对治疗中、重度痤疮，具有简单、有效、耐受性好、复发率低等优点，有良好的应用前景。[0004]同时，光敏剂5-氨基酮戊酸也应用于肿瘤手术中，5-氨基酮戊酸被人体吸收后，经过酶的作用代谢为原卟啉IX（PPIX），更多的PPIX富集在肿瘤细胞中，使肿瘤细胞中水平高于正常组织。 在特定波长的光照射下，肿瘤组织和正常组织呈现不同的颜色。欧洲EMEA，2011年11月 批准Gliolan (medac GmbH) 上市，其主要有效成分为5-氨基酮戊酸，用于在脑部肿瘤切除手术，利用5-氨基酮戊酸标定癌细胞，使其显现荧光，提升脑部肿瘤清除率。5-氨基酮戊酸作为显影剂用于肿瘤清除手术，帮助操作人员在术中准确的判断肿瘤组织的边界，极大提高了肿瘤组织的清除率。除脑胶质瘤外，此项研究将有可能推广到其他肿瘤外科手术中。此外，在罕见遗传性疾病急性肝卟啉症中，由于遗传缺陷引起体内代谢酶缺乏，使具有神经毒性的血红素中间体5-氨基酮戊酸积累，导致疾病发作和发作期间症状持续。5-氨基酮戊酸是一种合理的、可以预测临床获益的疾病生物标志物，检测尿液基质中的5-氨基酮戊酸对于疾病的确定和诊疗具有重大的意义。[0005]因此，需要建立一个灵敏度、精密度和准确度高，耐用性好的生物分析方法来定量分析检测生物基质中5-氨基酮戊酸的浓度，支持5-氨基酮戊酸作为内源性治疗药物的药代动力学和安全性评价，以及作为生物标记物评估疾病状态和治疗药物药代-药效关系（PK-PD）的研究。
[0006]检测5-氨基酮戊酸传统的方式，多为高效液相前端带紫外检测器和荧光检测器的方法。由于5-氨基酮戊酸紫外吸收弱，紫外检测方法的检出限高，无法满足生物基质样品中低浓度化合物的分析检测；5-氨基酮戊酸不具有荧光基团，采用荧光检测通常需要进行化学衍生化，形成具有荧光基团的化合物而被检测到，多应用在体外药物分析制剂评价。文献中报道的化学衍生试剂有：2 - 氨基3-羟基萘，氯甲酸-9-芴基甲酯，乙酰丙酮，丹磺酰氯等，衍生化反应时间长，反应温度约在100℃左右，其中乙酰丙酮衍生化形成的化合物其荧光强度随时间延长会显著的降低。荧光检测方法耗时费力，对衍生化试剂要求高，稳定性难
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以控制，方法的应用受到限制。此外，也检索到用表面增强拉曼检测法检测5-氨基酮戊酸的专利报告，由于生物基质的复杂性，其中内源性或者外源性的干扰多，该方法的专属性无法满足生物样品分析检测的要求。高效液相串联质谱技术由于具有：样品前处理，净化和富集目标化合物；液相分离系统，通过化合物极性的差异分离干扰；质谱检测系统，根据物质的分子质量以及结构的差异分离检测化合物，被广泛的应用于生物体内药物浓度检测和生物标记物的检测。目前，用高效液相串联质谱技术检测生物基质中5-氨基酮戊酸的文献报道较少，主要应用在临床诊断和体外制剂研究。如Ibrahim A. Alsarra et al 在《用验证过的UPLC-MS-MS方法定量分析5-氨基酮戊酸：应用于结肠靶向口服片剂的体外评估》中，5-氨基酮戊酸未经衍生化，经UPLC BEH C18 column (1.7 μm, 2.1 mm×50 mm) 色谱柱后，进入质谱检测，方法的定量下限浓度为1 μg/mL，用于体外评价口服片剂在结肠部位的释放特性。该方法中5-氨基酮戊酸在色谱柱上无明显保留，于死时间出峰，分离度低。由于制剂样品成份单一，方法满足该项目的需求（Journal of Chromatographic Science, Vol. 49, July 2011）。如Ozlem Dogan et al在《一种简单的定量分析5种尿卟啉，胆色素和5-氨基酮戊酸的色谱串联质谱法》中，检测尿液中5种尿卟啉，胆色素和5-氨基酮戊酸的浓度，其中5-氨基酮戊酸定量下限约6.55ng/mL，尿液样品经由甲酸酸化后进样于色谱串联质谱中检测。结果显示5-氨基酮戊酸在色谱柱上无保留，于死时间出峰，没有与样品中极性成分分离，影响分析检测的专属性（Ind J Clin Biochem, DOI 10.1007/s12291-017-0716-8）。如Jinglan Zhang et al在《一种能同时定量分析5-氨基酮戊酸和胆色素的高特异性和灵敏度的LC-MS/MS分析方法》中，检测生物基质中生物标记物5-氨基酮戊酸的浓度，血浆和尿液样品分别经过固相萃取后，正丁醇衍生化，进样液相质谱联用仪进行检测。该方法缺少对血浆和尿液基质中内源性5-氨基酮戊酸本底的考虑，影响检测结果的准确性，此外样品前处理中涉及的固相萃取耗材昂贵，造成分析检测成本增加（Journal of Chromatography B, 879 (2011) 2389– 2396）。[0007]因此，本领域需要研究一种方法，具有灵敏度高，专属性好，定量准确度高，操作简单，试验成本低，稳健度好的特性，能支持大批量生物基质样品中5-氨基酮戊酸的浓度检测工作。
发明内容
[0008]为了克服分析检测研究中：5-氨基酮戊酸极性大，在常规反相色谱柱上保留弱；生物基质中5-氨基酮戊酸浓度低，通常为纳克每毫升的浓度水平；5-氨基酮戊酸为内源性化合物，在生物体内存在高浓度的与5-氨基酮戊酸化学结构类似的内源性或者外源性干扰等问题，本发明要解决的技术问题是提供一种可以准确检测生物基质中痕量5-氨基酮戊酸的方法，该方法利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸，解决了生物基质中内源性5-氨基酮戊酸难以准确定量，干扰成分多，灵敏度低的问题，具有灵敏度高，通量高，操作简便，稳定性好，能节省大量经济与时间成本的优点，能满足大批量生物基质样品中5-氨基酮戊酸的浓度测定，可以广泛应用于药物研发中生物样品的分析检测。[0009]为解决上述技术问题，本发明提供的一种采用高效液相串联质谱测定生物基质中5-氨基酮戊酸的方法，包括以下步骤：
（1）5-氨基酮戊酸标准曲线和质控样品的配制：
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精密称量5-氨基酮戊酸的标准物质，用极性溶剂稀释配制成6-8个浓度梯度的标准曲线和4-5个浓度水平的质控样品工作溶液；将5-氨基酮戊酸标准曲线工作溶液按比例与替代基质混合，涡旋仪涡旋配制得到替代基质标准曲线样品；所述替代基质为不含有5-氨基酮戊酸标准物质；将5-氨基酮戊酸质控样品工作溶液按比例添加到真实空白基质中，涡旋仪混匀得到真实基质质控样品；低于真实空白基质中本底浓度的质控样品，由替代基质中加入质控工作溶液制备得到；
（2）稳定性同位素内标工作溶液配制：
精密称量稳定性同位素标记的5-氨基酮戊酸标准物质，稀释配制成单一浓度的内标工作溶液；
（3）样品除蛋白和衍生化处理：分别取混合好的标准曲线样品、真实基质质控样品、低于真实空白基质中本底浓度的质控样品、真实空白基质样品、未知浓度待测样品到容器中，加入步骤（2）制备的稳定性同位素内标工作溶液，涡旋混匀；对所有样品加入有机试剂，振摇后高速离心，取上清液用氮气吹干；每个样品中加入衍生化试剂，涡旋反应后离心，得待测样品；
（4）高效液相串联质谱分离检测：用高效液相色谱系统对步骤（3）制备的样品进行分离，用质谱进行检测；（5）方法标准曲线建立和准确性确证：将步骤（4）采集的数据，用替代基质中5-氨基酮戊酸的浓度，与在高效液相色谱串联质谱上对应仪器响应进行拟合，所述对应仪器响应为5-氨基酮戊酸和内标峰面积比值，建立5-氨基酮戊酸浓度与仪器响应的标准曲线；根据真实空白基质样品和质控样品的仪器响应，代入标准曲线中回算浓度，并评价方法的准确度；
（6）检测未知样品浓度：
将未知浓度待测样品的仪器响应值代入步骤（5）建立的标准曲线公式中，计算出未知浓度待测样品中5-氨基酮戊酸的浓度。[0010]进一步地，所述步骤（1）中5-氨基酮戊酸标准曲线和质控样品的配制，所述替代基质能模拟生物基质的溶液，用替代基质制备标准曲线；所述真实空白基质为生物液体基质，以及粪便和组织器官匀浆液，用真实空白基质制备质控样品，质控样品的浓度为添加的5-氨基酮戊酸与基质中本底浓度之和。所述生物液体基质为生物来源的全血或血清或血浆或尿液。
[0011]进一步地，所述步骤（1）中极性溶剂为水。[0012]进一步地，所述步骤（1）中，5-氨基酮戊酸标准曲线工作溶液与替代基质混合的体积比大于或等于1:20；5-氨基酮戊酸质控样品工作溶液与真实空白基质的体积比大于或等于1:20。
[0013]进一步地，所述步骤（3）中样品除蛋白和衍生化处理，所有样品加入有机试剂除去样品中的蛋白质，所得到的上清液吹干后与衍生化试剂进行反应，得到极性变小的衍生化合物；所述有机试剂为甲醇，所述衍生化试剂为正丁醇。[0014]进一步地，所述步骤（4）中高效液相串联质谱分离检测，所使用的液相系统为反相液相体系，质谱为三重四极杆质谱检测器。[0015]进一步地，所述步骤（4）中高效液相串联质谱分离检测，其中色谱条件：色谱柱：
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Waters XBridge Peptide BEH C18 Column, 300Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 100 mm；流动相组成：流动相A：含有0.1%甲酸的水溶液；流动相B：含有0.1%甲酸的甲醇溶溶；质谱条件：待测物和内标的离子对分别是，188.1/114.1和191.1/55.1；喷雾电压：5500 v；离子源温度：500 ℃；加热辅助气：50 psi。[0016]进一步地，所述步骤（5）中方法标准曲线建立和准确性确证，真实空白基质得到的仪器响应值代入标准曲线中回算，得到真实空白基质的本底浓度，结合加入的5-氨基酮戊酸的浓度计算出真实基质质控样品的理论浓度；仪器检测得到质控样品浓度与其理论浓度的偏差在±15%范围内，满足方法的准确度要求，能用于未知浓度待测样品的浓度检测；所述建立5-氨基酮戊酸浓度与仪器响应的标准曲线，该标准曲线的线性关系方程为：y=斜率*x+截距，其中x代表5-氨基酮戊酸在替代基质中的浓度，浓度范围为1.00-100 ng/mL，y代表所对应的仪器响应，所述对应的仪器响应为5-氨基酮戊酸与内标峰面积比值，截距是真实空白基质样品的仪器响应。
[0017]本发明具有以下有益效果：
1、本发明根据5-氨基酮戊酸化合物极性大（LogP值为-1.5）以及在生物机体中内源性的特性，用稳定性同位素内标结合替代基质法，建立标准曲线，对生物基质样品进行准确定量分析。基于5-氨基酮戊酸的溶解性，选择出可作为替代基质的多种溶液。[0018]2、本发明利用有机试剂去除基质样品中的蛋白质，用盐酸与正丁醇的混合溶液进行常温短时间衍生化处理，得到的5-氨基酮戊酸丁醇衍生化物的极性降低，在常规反相色谱体系上保留大大增强，丁醇基团的引入同时增加了5-氨基酮戊酸在质谱上的响应，灵敏度增加，定量下限可以达到0.5ng/mL浓度水平。[0019]3、本发明利用稳定性同位素内标法，对于基质样品中5-氨基酮戊酸的蛋白沉淀衍生化前处理，色谱保留，基质效应以及质谱的离子化效率和检测，起到很好的监控作用，使得方法更加稳定可靠。[0020]4、本发明利用蛋白沉淀和衍生化前处理，使用的试剂经济实惠，反应条件温和，操作简单易行，能够用于大量生物基质样品的分析检测。[0021]5、本发明解决了生物基质中内源性5-氨基酮戊酸难以准确定量，干扰成分多，灵敏度低的问题，具有操作简单，灵敏度高，通量高与成本低的优点，能满足大批量生物基质样品中5-氨基酮戊酸的浓度测定。
[0022]
附图说明
[0023]图1是5-氨基酮戊酸标准曲线图。
[0024]图2是在替代基质中5-氨基酮戊酸为1ng/mL下限样品色谱图。[0025]图3是未添加5-氨基酮戊酸的人血浆基质样品色谱图。[0026] 图4 是在人血浆基质中添加5-氨基酮戊酸至高浓度质控样品色谱图。
[0027]
具体实施方式
[0028]下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发
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明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0029]以下各实施例中所用试剂未做特别说明的均为商品化试剂，其中，5-氨基酮戊酸
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盐酸盐标准物质购买与TLC，C2,15N-5-氨基酮戊酸标准物质为内部合成，甲醇、正丁醇、盐酸分别购买于Merck，Sigma-Aldrich和上海凌峰化学试剂有限公司。[0030]实施例1
a．5-氨基酮戊酸标准曲线和质控样品的配制：精密称量5-氨基酮戊酸的标准物质，稀释配制成8个浓度梯度（5-氨基酮戊酸浓度为20.0， 40.0，100，300， 500，1000，1600，2000 ng/mL）的标准曲线和相应浓度的质控样品工作溶液（5-氨基酮戊酸浓度为20.0，60.0，800，1400 ng/mL）。用替代基质，将5-氨基酮戊酸标准曲线工作溶液按比例（1:20，v/v）与替代基质混合，涡旋仪涡旋，配制得到替代基质标准曲线。将5-氨基酮戊酸质控样品工作溶液按比例（1:20，v/v）添加到真实空白基质中，涡旋仪混匀，质控样品的浓度为添加的5-氨基酮戊酸与基质中本底浓度的和。低于真实空白基质中本底浓度的质控样品，由替代基质中加入质控工作溶液制备得到。[0031]b．稳定性同位素内标工作溶液配制：精密称量稳定性同位素标记的5-氨基酮戊酸标准物质13C2,15N-5-氨基酮戊酸，稀释配制成单一浓度的内标工作溶液。[0032]C．样品除蛋白和衍生化处理：取混合好的标准曲线样品、替代基质质控样品、真实空白基质样品，未知浓度样品100微升，加入到深孔96孔板中，加入步骤b制备稳定性同位素内标工作溶液20微升，涡旋混匀；对所有样品加入有机试剂480甲醇，在摇板机涡旋使充分沉淀；高速离心后，取350微升上清液转移到一块新的96孔板中用氮气吹干；每孔加入200微升衍生化试剂 ，涡旋反应后离心，取200微升反应后溶液转移到新的96孔板中待检测。[0033]d．高效液相串联质谱分离检测：用高效液相反相色谱柱Waters XBridge Peptide BEH C18 Column, 300Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 100 mm），结合流动相（流动相A：含有0.1%甲酸的水溶液；流动相B：含有0.1%甲酸的甲醇溶液）的液相条件对步骤3制备的样品进行分离，用串联质谱进行检测，多反应离子监测的质谱条件，其中待测物和内标的离子对分别是，188.1/114.1和191.1/55.1，喷雾电压：5500 v，离子源温度：500 ℃，加热辅助气为50 psi。
[0034]e．方法标准曲线建立和确证：将步骤d采集得到的数据，用替代基质中5-氨基酮戊酸的浓度，与在高效液相色谱串联质谱上5-氨基酮戊酸和内标的峰面积比值进行拟合，建立5-氨基酮戊酸浓度与仪器响应的标准曲线。将真实空白基质得到的仪器响应代入标准曲线中，得到真实空白基质的本底浓度，据此计算出真实基质的质控样品的理论浓度。仪器检测的质控样品浓度与其理论浓度的偏差在±15%范围内，满足方法的准确度要求，可以用于未知生物样品浓度的检测。[0035]按上述方案，替代基质中配制不同浓度的5-氨基酮戊酸标准曲线，标准曲线回归数据结果如图1和表1所示，质控样品检测浓度与理论浓度的偏差统计如表2所示。
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如图1所示，5-氨基酮戊酸在替代基质中1.00-100 ng/mL浓度范围内（横坐标x），
所对应的仪器响应（纵坐标y），即待测物5-氨基酮戊酸与内标峰面积比值，显示5-氨基酮戊酸在1.00-100 ng/mL浓度范围内，仪器响应成线性，拟合得到的线性关系方程为：y=0.02983x+0.002998，决定系数 r2=0.9998，决定系数r2反映模型拟合优度的重要统计量。[0037]从以上图1和表1、表2的数据可以看出在1.00~100ng/ml的检测范围内，替代基质中标准曲线准确度在±5%以内，线性良好。真实生物基质中，中间浓度质控样品和高浓度质控样品准确度分别为-1.8%和0.2%，方法精密度高准确性好，方法稳定可靠。[0038]如图2所示，在替代基质定量下限1ng/mL的样品中，上面为5-氨基酮戊酸衍生化物色谱图，下面为5-氨基酮戊酸内标衍生化物色谱图，色谱峰保留时间都为2.49分钟。[0039]如图3所示，上面为生物基质中内源性5-氨基酮戊酸衍生化后的色谱图，保留时间为2.49分钟，与基质中的其他干扰物达到基线分离。下面为5-氨基酮戊酸内标衍生化物的色谱图，保留时间为2.48分钟。[0040]如图4所示，在真实空白基质中添加5-氨基酮戊酸至高浓度质控样品，上面为5-氨基酮戊酸衍生化物色谱图，2.49分钟的色谱峰含有内源性的5-氨基酮戊酸和后添加的5-氨基酮戊酸，下面为5-氨基酮戊酸内标衍生化物色谱图，色谱峰保留时间都为2.48分钟。[0041]综上所述，上述实施例仅为本发明的较佳实施例之一而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
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图1
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图2
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图4
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