3种不同虾类虾头中酶的筛选

吴燕燕;王萍;李来好;杨贤庆;刁石强

【摘 要】以凡纳滨对虾、罗氏沼虾、斑节对虾的加工下脚料——虾头为原料,通过酶的提取、酶活测定及酶含量的分析,对这3种虾类虾头中的蛋白酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶、多酚氧化酶等酶类进行筛选和评价.结果表明:3种虾类的虾头中凡纳滨对虾虾头的蛋白酶酶活力为39 615.8(±3 108.4)U/gprot,约为其他2种虾的2倍；而罗氏沼虾虾头的碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶具有较高活性,斑节对虾虾头的乙酰胆碱酯酶含量较高,在3种虾类的虾头中均未检测到溶菌酶. 【期刊名称】《广东农业科学》 【年(卷),期】2011(038)014 【总页数】4页(P116-119) 【关键词】虾头;酶;筛选

【作 者】吴燕燕;王萍;李来好;杨贤庆;刁石强

【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;上海海洋大学食品学院,上海201306;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300

【正文语种】中 文

【中图分类】Q814.1

目前，生物酶已广泛应用于食品、医药、纺织、造纸等各个领域，在其工业生产过程中，直接从生物体内提取、纯化是一种十分重要的手段。鉴于生物酶的广泛应用及生物资源的短缺，从海洋生物资源中寻找新的酶源是当前的研究热点。海洋鱼虾等水产品体内特别是内脏中含有丰富的酶源，对其进行开发具有较强的可行性。20世纪90年代初，冰岛、挪威、日本、丹麦、英国等国家就已经开始研究鱼内脏酶，并将其商业化应用于鱼加工废弃物的处理及食品生产等领域[1]。国内外研究者对水产鱼类的内脏酶研究较多[2-3]，但对水产虾类内脏酶的报道较少。 我国虾类产量巨大。根据联合国粮农组织(FAO)FishStat数据库的数据统计，2006年我国对虾养殖产量已达124万t，占全球养殖对虾产量的39.2%，此外，各类捕捞虾的产量也很大。2008年，我国罗氏沼虾淡水养殖产量达12.7万t，凡纳滨对虾总产量10.6万t，虾产量的提高为水产品加工及贸易的发展提供了充足的原料。2008年全国对虾加工量为31.9万t，其中仅广东省的虾类加工量就高达12.8万t，全国冻虾仁对外出口量达4万t[4]。同时虾类加工过程中产生了虾头、壳等大量废弃物，目前，我国虾头废弃物大部分用于生产饲料，虾粉。近年来，国内水产研究者有了更新的研究进展。朱志伟等[5]分析和比较了虾头内源蛋白酶与多种外源酶对虾头的酶解工艺。章超桦等[6]系统的研究了南美白对虾虾头加速自溶的条件、虾头自溶动力学，并对虾头的自溶产物的主要成分进行了分析，为新型虾味调味料的开发研究奠定了一定基础。目前较多的研究以如何更有效的采用虾头内源酶酶解技术为重点，但尚未有对虾头中丰富的内源酶属于哪些酶类进行研究。虾头中酶的种类较为复杂，且含量不同。为了对虾头内脏中的酶资源有更充分的了解，发现其中深层次的经济价值，对其进行酶资源的筛选工作必不可少。本研究采用列举法对我国大宗养殖加工的凡纳滨对虾、罗氏沼虾、斑节对虾3种虾的虾头

中可能存在的经济价值较高的酶进行了逐一的活性筛选和分析，为虾头中具有较高经济价值的酶类的开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料

凡纳滨对虾、罗氏沼虾、斑节对虾，由中山水产品进出口集团公司提供，虾头为虾加工下脚料，于-20℃保存。

仪器设备：电子控温水浴锅、紫外分光光度计GENESYS 5、SIGMA冷冻离心机等。

试剂：1%酪蛋白、牛血清蛋白、0.4 mol/L三氯乙酸（TCA）、考马斯亮兰 G250、酸性磷酸酶（ACP）活性测定盒、碱性磷酸酶（AKP）活性测定盒、乙酰胆碱酯酶（TChE）活性测定盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性测试盒等。 1.2 试验方法

1.2.1 蛋白质浓度的测定 采用考马斯亮兰G250法[7]，标准蛋白为牛血清蛋白。 1.2.2 虾头中酶的提取 称取一定量的虾头，按1∶3(W∶V)加入 0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液（pH＝7.0），制成 25%的匀浆，于4℃下间歇性搅拌1 h，10 000 r/min离心15 min，取上清液即为粗酶液。

1.2.3 酶活测定 蛋白酶的测定：基本按照Folin酚法[8]并做适当修改，酶液适当稀释。取4支试管并编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1 mL，1号管立即加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，使酶失活；另3支样品加入l mL不同pH、浓度为1%的酪蛋白底物缓冲液，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴锅中，保温10 min后（准确计时），立即加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1 mL 1%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20 min；取出离心除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1 mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL和已稀释的福林—酚试剂0.5 mL，

摇匀，保温显色20 min后，进行比色测定(波长650 nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。酶活定义：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶活力单位。

式中，A为由样品测得的OD值，查标准曲线得到的相应的酪氨酸微克数；4表示从4 mL反应液中取出1 mL测定(即4倍)；N为酶液稀释的倍数；10表示反应10 min。

多酚氧化酶(PPO)活性测定：采用吴汉民[9]的L—脯氨酸—儿茶酚分光光度法测定PPO活性，即将0.067 mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.2)2.2 mL、0.5 mol/L L—脯氨酸0.2 mL、0.5 mol/L儿茶酚0.2 mL、酶液0.4 mL，于 37℃恒温水浴中放置10 min，然后用分光光度计检测混合液在530 nm处的吸光度OD值。以酶反应的初速度表示酶活力。酶活力单位：以每分钟每毫升酶液引起吸光度值改变0.01为1个酶活力(U)。

碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶(ACP)、乙酰胆碱酯酶（TChE）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）的测定方法均按照购买的试剂盒的酶活测定方法进行。

测定每种虾的各种酶类时设定2个平行空白、4个平行样品，试验重复3次。 2 结果与分析

由表1可知，筛选的多种酶类除溶菌酶外都存在，各种酶含量因虾种类的不同而有差异。3类虾中，凡纳滨对虾虾头中蛋白酶含量最高，为39 615.8(±3 108.4)U/gprot，是罗氏沼虾的2.5倍、斑节对虾的1.6倍；罗氏沼虾虾头中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶含量最高，分别为 347.5(±45.6)、192.0(±33.7)、38 353.3(±681.3)U/gprot；凡纳滨对虾虾头中乙酰胆碱酯酶的含量最高，为14 982.9(±141.1)U/gprot，约是罗氏沼虾的12倍、斑节对虾的6倍；

3种虾虾头中多酚氧化酶的含量差异较小，由大到小依次为斑节对虾(379.5±22.1 U/gprot)、凡纳滨对虾(268.4±28.6 U/gprot)，罗氏沼虾(213.1±12.9 U/gprot)。 3 结论与讨论 3.1 蛋白酶

蛋白酶作为工业用酶的3大主要酶制剂之一，在食品、日化、医药等领域应用广泛。目前，海洋生物酶研究中有关鱼类内脏蛋白酶的研究报道较多，并有较多成果转化成产业。如布亚纳森·乔·布拉吉发明并公开了从鱼中提取的丝氨酸蛋白酶、从鳕鱼(如大西洋鳕鱼)中提取的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，能治疗各种疾病和紊乱[10]。国内外的研究者发现虾类中也存在丰富的内源蛋白酶，并采用内源蛋白酶水解技术对水产品加工副产物进行处理，获得了具有更高经济价值的水解产物。如Hong等[11]对虾头内源酶酶解虾肉产物的ACE抑制活性及其降低原发性高血压（老鼠血压）的效果进行了研究。

表1 3种不同虾类虾头中多种酶的比较分析注：A为凡纳滨对虾；B为罗氏沼虾；C为斑节对虾；比活力（U/gprot）为10mL粗酶液中总酶活与总蛋白含量的比。虾名名称蛋白酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶乙酰胆碱酯酶超氧化物歧化酶总酶活（U）4207.2±330.1 2187.2±108.6 2343.2±090.5 5.5±0.9 49.7±6.5 7.2±0.6 17.2±2.9 27.5±4.8 6.6±0.2 143.4±15.0 177.2±19.7 232.2±25.0 2513.1±377.2 5489.1±97.50 2405.9±121.5比活力（U/gprot）

39615.8±3108.4 15282.3±758.60 24360.1±940.90 53.1±8.5 347.5±45.6 74.6±6.1 162.3±28.1 192.0±33.7 68.4±1.6 14982.9±141.10 1238.0±137.9 2414.0±260.2 23667.0±3552.4 38353.3±681.30 25013.0±1262.9溶菌酶------多酚氧化酶268.4±28.6 213.1±12.9 379.5±22.1

ABCABCABCABCABCABCABC粗酶体积（mL）10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10蛋白总含量（mg）106.2±20.1

143.1±30.4 96.2±12.7 106.2±20.1 143.1±30.4 96.2±12.7 106.2±20.1 143.1±30.4 96.2±12.7 106.2±20.1 143.1±30.4 96.2±12.7 106.2±20.1 143.1±30.4 96.2±12.7 106.2±20.1 143.1±30.4 96.2±12.7 106.2±20.1 143.1±30.4 96.2±12.7 28.5±3.0 30.5±1.9 36.5±2.1

本研究结果表明，凡纳滨对虾虾头占体重的35.58%，罗氏沼虾占58.69%，斑节对虾占40.81%，可见凡纳滨对虾虾头较小。此外，同样10 mL酶液，凡纳滨对虾的粗酶蛋白质含量低于罗氏沼虾，但凡纳滨对虾虾头的蛋白酶酶活却明显高于罗氏沼虾和斑节对虾，后两者之间的差别较小，估算凡纳滨对虾虾头粗酶酶活为1 682.88(U/g raw materil)，近于尼罗罗非鱼肠道粗蛋白酶1 500~2 000(U/g raw materil)[12]，说明凡纳滨对虾虾头中蛋白酶的提取对于水产品废弃物的综合利用具有一定意义。

目前凡纳滨对虾的市场价格低于罗氏沼虾和斑节对虾，且产量较大，因此凡纳滨对虾虾头蛋白酶的开发前景较大。 3.2 磷酸酶

磷酸酶又称正磷酸单醋水解酶，是一种能催化各种含磷化合物水解的酶类，根据其催化时的最适pH特性，又可分为酸性磷酸酶(EC3.1.32)和碱性磷酸酶(EC3.1.31)两类。磷酸酶具有非常重要的生理功能，它广泛存在于各种动物体内，是动物体内重要的解毒体系，并且在动物机体的骨化过程、在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中都有重要作用[13]。碱性磷酸酶可用于核酸、毒物学及医学研究。由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，该酶还可添加到药用化妆品中[14]。酸性磷酸酶是一种有广泛应用价值的生化试剂，可专一性地水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基因的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一[15]。

本研究结果显示，罗氏沼虾虾头中的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性均高于凡纳滨

对虾和斑节对虾，其中罗氏沼虾虾头中的碱性磷酸酶酶比活为347.5 U/gprot，明显高于凡纳滨对虾(53.1 U/gprot)和斑节对虾(74.6 U/gprot)。而用同样方法测得的10%鱼肝组织匀浆酶比活为13.917 U/gprot，1%鸡肝组织匀浆比活为32.37 U/gprot，说明罗氏沼虾碱性磷酸酶具有广阔的开发前景。 3.3 乙酰胆碱脂酶

近年来，为防止蔬菜水果上农药残留引起的急性食物中毒，快速检测农药残留的多种方法应运而生。乙酰胆碱酯酶的活性受到有机磷或氨基甲酸酯类农药的特异性抑制，因此它成为酶法检测农药残留方法中重要的酶类。乙酰胆碱酯酶目前的主要来源为昆虫头部、动物红细胞等[16]。

本研究结果发现，斑节对虾虾头中乙酰胆碱酯酶的活性为2

414.0(±260.2)U/gprot，高于凡纳滨对虾和罗氏沼虾，而10%中华鲟脑组织匀浆中乙酰胆碱酯酶的活性为0.5840 U/mgprot。估算斑节对虾虾头中乙酰胆碱酯酶粗酶活力为956.5(U/g raw material)，明显高于罗非鱼肝脏中乙酰胆碱酯酶的酶活性13.2(U/g raw material)，以及黃鱼脑和猪血块中的酶活252和9.1(U/g raw material)[2]，将其开发研制成快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的试剂盒，用于蔬菜、水果生产和销售的现场检测，具有很好的市场前景。 3.4 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶是一类广泛存在于动物、植物和微生物等多种生物体内的金属酶，该酶可清除、平衡体内的氧自由基，从而避免当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、抑制肿瘤和自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，得到国内外学者的广泛关注[17]。

本研究结果表明，罗氏沼虾虾头的SOD酶活为38 353.3(±681.3)U/gprot，明显高于斑节对虾和凡纳滨对虾，后两者之间的SOD酶酶活差异较小。而0.5%中华鲟肝组织匀浆SOD酶比活为105.647 U/mgprot，10%蚯蚓匀浆SOD酶比活为

9.353 U/mgprot。估算罗氏沼虾虾头粗酶酶活为15 341.3(U/g raw material)，而罗非鱼肝脏粗酶酶活为1 958(U/g raw material)[2]，说明SOD酶在罗氏沼虾虾头中含量较高，具有一定的开发价值。 3.5 溶菌酶

溶菌酶是一种有效的抗菌剂，能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-l,4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下使细胞胀裂开，引起细菌裂解。由于溶菌酶对人体细胞无毒性作用，因此，溶菌酶已广泛应用于医疗、饲料、食品等领域[18]。但本试验均未从3种虾类中检测到溶菌酶。 3.6 多酚氧化酶

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是自然界中分布极广的一种金属氧化还原蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。能催化两类不同的反应，可以使一元酚羟基化，生成相应的邻二羟基化合物，也可以氧化邻苯二酚生成黑色物质醌[19]。这一特性使得多酚氧化酶在工业食品和环境保护等行业得到了广泛的应用，如利用多酚氧化酶催化氧化儿茶素形成茶黄素及茶饮料中独特的风味物质，烟草中利用其来形成独特的品质，利用固定化多酚氧化酶去除工业污水中的多酚类有毒物质等[20]。

多酚氧化酶是促使水产品虾类保鲜过程中产生黑变的主要因素。本试验中，凡纳滨对虾的多酚氧化酶活性为268.4(±28.6)U/gprot，罗氏沼虾为

213.1(±12.9)U/gprot，斑节对虾为379.5(±22.1)U/gprot，三者之间的差异较小。若对其展开全面的基础研究，包括分析其结构、特性等，并据此在已有的抑黑变技术上探索和开发更先进、更安全可靠的方法。这样就可解决虾类流通加工过程的黑变问题，从而大力促进虾类水产养殖业的发展。

本研究分别以凡纳滨对虾、罗氏沼虾、斑节对虾3种虾的虾头为研究对象，采用列举法，选取了7种经济价值较高的酶进行了筛选、评价，研究结果表明，3种虾

的虾头中以蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶含量较高，其次是碱性磷酸酶和酸性磷酸酶、多酚氧化酶，虾头中不含有溶菌酶。

凡纳滨对虾、罗氏沼虾、斑节对虾是我国主要的养殖经济虾类，养殖加工产量大，加工过程产生大量的虾头，针对当前酶制剂工业急需开发新型的酶资源，进一步研究虾头中酶活性和含量较高的蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶的提取纯化和酶学性质，研究其在水产行业乃至食品等轻工行业中的应用效果，不仅为酶工程提供了新的酶源，也可为虾头合理加工提供了理论依据，具有较大的理论意义和实际应用价值。 参考文献：

[1]Silvia V,Zulema C.Marine fish digestive proteases—relevance to food industry and the south-west Atlantic region—a review[J].Food Chemistry,1996,20(1):193-214.

[2]郝志明,吴燕燕,李来好.罗非鱼内脏中酶的筛选[J].南方水产,2006，2(2):38-42. [3]吴燕燕,李来好,郝志明,等.罗非鱼肠蛋白酶的分离纯化及性质[J].水产学报,2010,34(3):358-366.

[4]农业部渔业司.2008中国渔业统计年鉴[M].北京:中国农业出版社,2009:34-41. [5]朱志伟,曾庆孝,林奕封,等.虾头的內源蛋白酶酶解及复合酶解研究[J].武汉工业学院学报,2003,22(2):4-7.

[6]伍彬,章超桦,吉宏武,等.南美白对虾虾头自溶产物主要呈味成分分析[J].食品科学,2010,31(10):184-187.

[7]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitiesofprotein utilizingtheprinciple of protein dye binding[J].Anal.Biochem,1976,72:248-254.

[8]Natalia Y,Hashim R,Ali A,et al.Characterization of digestive enzymes in

camivorous ornamental fish,the Asian bony tongue Scleropages formosus(Osteoglossidae)[J].Aquaculture,2004,223:305-320.

[9]吴汉民,娄永江.仿对虾酚氧化酶系的提取、纯化及分析——对虾防黑变机理研究系列之一[J].浙江水产学院学报,1991,10(2):85-9l.

[10]布亚纳森·乔·布拉吉.鱼丝氨酸蛋白酶及其在制药和化学品上的应用[P].冰岛,A6/K38/48,CN00809111.0,2005-04-20.

[11]Hong P-Z,Cao W-H,Hao G X,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of shrimp meat hydrolysate by endogenous enzymes from shrimp head and its antihypertensive effects on spontaneously hypertensive rats[J].Fisheries of China,2007,31(1):76-82.

[12]龚翠,周爱梅,戴结玲,等.尼罗罗非鱼肠道碱性蛋白酶性质的研究[J].食品工业科技,2010,31(9):197-199.

[13]何海琪,孙凤.中国对虾酸性和碱性磷酸酶的特性研究[J].海洋与湖沼,1992,23(25):555-560.

[14]Wang Y-B,He Z-L.Effect of probiotics on alkaline phosphatase activity and nutrientlevelin sedimentofshrimp,Penaeus vannamei,ponds[J].Aquaculture,2009,287:94-97.

[15]张树政,孟广震.酶与研究技术(上)[M].北京:科学出版社,1987:177-182. [16]李昕,王忠斌,张燕,等.乙酰胆碱酯酶在有机磷和氨基甲酸酯类农药快速检测中的应用[J].食品研究与开发,2007,28(3):127-129.

[17]何献君,梁晓东,吕晓峰,等.超氧化物歧化酶应用研究现状[J].中国医药指南,2010,8(15):37-39.

[18]Blake C C,Koenig D F,Mair G A,et al.Structure of hen eggwhite lysozyme.A three-dimensionalfouriersynthesisat2 angstrom

resolution[J].Nature,1965,206:757-761.

[19]周春梅,王欣,王俊城,等.白玉菇多酚氧化酶酶学特性[J].食品与发酵工业,2010,36(5):6-8.

[20]袁新跃,江和源,张建勇.多酚氧化酶固定化载体研究进展[J].茶叶科学,2009,29(4):319-324.