《微生物与微生物工程实验》
指导手册
西北师范大学生命科学学院
微生物学团队 2014年9月编制
目 录
前言 ...................................................................................................................................... 1 微生物实验室安全须知 ....................................................................................................... 2 微生物实验注意事项 ........................................................................................................... 3 微生物与微生物工程实验用器材一览表 ............................................................................ 9 微生物与微生物工程实验教学进度表（必修） ............................................................... 10 实验设计方案与实验报告撰写要求 .................................................................................. 11 实验内容指导 .................................................................................................................... 12 实验一 (I) 普通光学显微镜的使用 ............................................................................ 12 实验一 (II) 细菌的涂片及简单染色法 ....................................................................... 16 实验二 四大类微生物菌落及细胞形态的观察 ........................................................... 19 综合大实验(三~十) 产酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化 ........................ 25 附录 .................................................................................................................................... 32 附录1 微生物实验常用菌种及其学名 ....................................................................... 32 附录2 常用培养基成分及其配制 ............................................................................... 33 附录3 常用染色液和试剂的配制 ............................................................................... 36 附录4 常用缓冲液配制表........................................................................................... 40 附录5 常用消毒剂表 .................................................................................................. 41 参考文献 ............................................................................................................................ 42
前言
为适应现代大学开放性、综合性、创新性实验教学改革的要求，经微生物学团队讨论，在2012级生物技术和制药工程专业开展《微生物与微生物工程实验》教学改革初步尝试。
本实验指导手册只提供实验内容的基本纲要、基本思路、基本方法和主要参考书目，具体的实验内容（实验三~实验十）须要同学们借助微生物学及相关课程的理论和实验教材，在教师的辅助指导下，自主设计、自主实施、协作分工。
希望通过本次实验教学改革，达到以下目的：
1、通过一个综合设计实验，贯穿微生物学研究的主要技术和方法，使实验内容系统化、整体化，使同学们对微生物学研究技术和方法的认识更加系统全面；
2、通过自主设计、实施实验，提高同学们对实验课程的积极性和主动性，培养同学们的自主性、创造性、协作精神和统筹能力，锻炼基本科学研究能力。
同时也希望同学们本着对自己和实验小组负责的态度，认真投入时间和精力，尽力设计、筹划、实施所设计的实验内容，配合教师做好本次实验教学改革。
由于初次尝试，在本实验课程时间安排、人员协调、内容衔接、仪器设备和场地提供等诸多方面都会出现不可预期的问题，还望同学们予以配合和谅解！
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微生物实验室安全须知
普通微生物学实验课程的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。
为了提高教学效果，保证实验质量和实验室安全，特提出如下注意事项： 1．每次实验前必须对实验内容进行充分預习以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路淸楚。
2．认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。
3．实验室内应保持整洁，勿离声谈话和随便走动，保持室内安静。 4．实验时要小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打玻、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
5．实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰，如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火，必要时用灭火。
6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护，对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。
7．每次实验完毕后，必须把所用仪器摆放妥当，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炎酸液覆盖0.5h后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间，凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须涂在3%来苏尔液中进行消毒。
8．每次实验需进行培养的材料，应标明自己组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养，实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得捎出室外。
9．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入实验报告中，力求简明准确，认真回答思考题，并按时提交实验报告供教师批阅。
10．离开实验室前将手洗干净，注意关闭仪器、水电、门窗和灯等。
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微生物实验注意事项
一、无菌操作要求
1．接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
2．进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
3．进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
4．从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
5．接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
6．接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。
7．吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、无菌间使用要求
1．无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5~0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2．无菌间内应保持清洁，工作后用2%~3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。
3．无菌间使用前后应将门关紧，紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
4．处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
5．在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
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三、消毒灭菌要求
微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。
（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1．灭菌前准备
（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。
（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
2．装放
（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
（2）大型高压蒸汽锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
3．设备检查
（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
（2）检查压力表蒸汽排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。
（3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。
4．灭菌处理
(1) 干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。
① 器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在表面的污物炭化。
② 灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。 ③ 菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5~2h。
④ 灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。 (2) 手提式高压锅或立式压力蒸汽灭菌器的使用应按下列步骤进行： ① 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）.
② 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。
③ 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。
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④ 关闭排气阀，使蒸汽压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。
⑤ 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。
（二）间歇灭菌方法
1．灭菌方法系利用不加压力的蒸汽灭菌，某些物质经高压蒸汽灭菌容易破坏，可用此法灭菌。
(1) 将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。 (2) 关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10-20min。
(3) 灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。
2．血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。
(1) 在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。
(2) 将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。
3．煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min，加入0.02﹪甲醛, 80℃煮60 min均可达到灭菌目的, 但选用煮沸消毒的增消剂时, 应注意对物品的腐蚀性.
4．灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。
(1) 物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。
(2) 取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。 (3) 培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。
(4) 启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。
(5) 取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。
(6) 取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。
(7) 凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。
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(8) 每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。
四、有毒有菌污物处理要求
微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。 1．经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。
2．经微生物污染的培养物，必须经121℃、30min高压灭菌。
3．染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。
4．涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。
5．打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。
污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
五、培养基制备要求
因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养基制备的质量将直接影响微生物生长。
培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：
1．根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。
2．pH
其测定及调节：pH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，pH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基pH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的pH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完pH后再加入。
3．培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。
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4．盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。 5．培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃、15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。
6．每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。
7．目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测pH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。
8．每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。
六、样品采集及处理要求
1．所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。
2．根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。 3．采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。
4．样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1~5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。
5．检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等）观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。
(1) 样品经特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。 (2) 瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。
(3) 按规定采样数量不足者。
检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃对送检符合要求的样品，冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。
6．样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。
(1) 液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。
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(2) 固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225mL灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。
(3) 瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。
七、样品检验、记录和报告的要求
1．检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。
2．样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
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微生物与微生物工程实验用器材一览表
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
器材名称 接种环 接种针 移液管 移液管筒 培养皿 培养皿筒 三角烧瓶 三角烧瓶软塞 试管 试管配套软塞 铝制试管架 载、盖玻片 玻璃烧杯 量筒 玻璃漏斗 吸耳球 试剂瓶（带滴管） 玻璃搅拌棒 菌液涂布棒 具塞刻度试管 塑料离心管 镊子 光学显微镜 酒精灯 擦镜纸 纱布 橡皮筋 双层瓶 记号笔 实验试剂 规格 金属柄杆+环丝金属柄杆+针丝单位 根 根 只 个 套 个 个 个 只 个 个 片 个 只 只 个 个 根 根 支 个 把 台 个 本 片 条 个 只 数量/组 1 1 5/5 1 20 1 5 5 20 20 1 5 2 1 1 1 5 2 2 10 10/10 2 1 1 1 5 10 1 1 公用 领取签单 5mL/1mL 长38/直径6 9cm 高21/直径10.5 250mL 符合口径 15*150mm 符合口径 40孔 25*75mm 250mL 100mL 9cm 50mL 20 mL 10mL/5mL 9
微生物与微生物工程实验教学进度表（必修）
实验序号 实验一 实验二 编号 1 2 实验名称 普通光学显微镜的使用与细菌的简单染色 四大类微生物菌落及细胞形态的观察 淀粉酶产生菌的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化 综合大实验 3 蛋白酶产生菌的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 3-6 3-7 3-8 产酶菌种选择性培养基的设计、配制与灭菌 产酶菌种的固态平板纯种分离与保藏 产酶菌种的染色与观察 产酶菌种的常规生理生化反应测试 菌种的生长曲线及产酶性能测试 紫外线对菌种产酶性能的诱变效应 环境因素对菌种生长及产酶性能的影响 培养基成分对菌种生长及产酶性能的影响 4 3 3 4 4 4 3 4 学时 3 4
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实验设计方案与实验报告撰写要求
一、实验设计方案要求
1、根据实际分组情况，各小组自行分工协作，在参阅本实验指导的基础上，统一查阅相关资料设计综合实验方案。
2、实验一和实验二的内容可直接参阅本实验指导。
3、实验三至实验十的设计方案，请各小组在参阅本指导的基础上自行讨论设计，为自主开放性实验内容。
4、实验设计方案内容包括：（1）设计背景、（2）目的意义、（3）实验内容、（4）实验所需仪器设备和耗材、（5）实验技术路线、（6）具体实施方案、（7）实验日程安排、（8）预期成果、（9）小组成员及分工。
5、每小组在正式开始实验工作前须预先提交一份实验设计方案。
二、实验报告撰写要求
实验课程结束后，每位同学根据小组的实验结果须提交一份实验报告。 实验报告撰写的主要内容及格式如下： 封面
1 实验背景、目的和意义 2 材料与方法 2.1 材料与试剂 2.2 实验方法 3 结果与分析 3.1 实验结果 3.2 分析与讨论 4 主要结论
5 实验中存在的问题及对策分析 6 对实验改革的意见和建议 7 小组成员名单、分工及贡献率
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实验内容指导
实验一 (I) 普通光学显微镜的使用
本部分实验内容请参阅实验教程实验2（Page8-12）
【目的要求】
1. 了解普通光学显微镜的构造和原理。
2. 练习并掌握显微镜的正确使用方法，特别是油镜的使用技术与原理。
【实验概述】
在微生物学研究中，普通光学显微镜最为常用，主要用于微生物细胞形态和构造的观察、细胞计数等。
普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。
1．机械部分
（1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。
（2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。
（3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。
（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。
（5）物镜转换器（旋转器）：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3-4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。
（6）镜台（载物台）：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器（推片器），推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。
（7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。
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①粗调节器（粗螺旋）：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大辐度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。
②细调节器（细螺旋）：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。
2．照明部分
照明部分包括光源和聚光器，有时另外加各种滤光片以控制光的波长范围。 聚光器位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。聚光镜由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。
3．光学部分
（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2-3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。
（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3-4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。
在物镜上，还有镜口率（N．A．）的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：
物镜 镜口率（N．A．） 工作距离（mm） 10× 0.25 5.40 40× 0.65 0.39 100× 1.30 0.11
表中的工作距离是指显微镜处于工作状态（物象调节清楚）时物镜的下表面与盖玻片（盖玻片的厚度一般为0.17mm）上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。
显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。
【实验材料】
1. 菌种 细菌标本片
2. 试剂和器材 显微镜及双层瓶（內瓶盛香柏油，外瓶盛1:3的乙醇、乙醚混合液或二甲苯），擦镜纸、吸水纸。
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【实验方法】
1. 取镜与放置 显微镜平时存放在镜箱中，用时从镜像中取出，右手紧握镜臂，左一手托住镜座，将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边6-7cm为宜，便于坐着操作。
2. 取光与对光 接通电源，打开光源开关，调节光强到合适大小。用拇指和中指移动旋转器（切忌手持物镜移动），使低倍镜对准镜台的通光孔（当转动听到碰叩声时，说明物镜光轴已对准镜筒中心）。先把镜头调节至距载物台1～2cm左右处，然后用双眼注视目镜内，接着调节聚光器的高度，把孔径光阑调至最大，使光线通过聚光器入射到镜筒内，这时视野内呈明亮的状态。
3. 低倍镜观察 低倍镜镜面大、视野宽，易于发现目标和确定待检位置，故任何被检标本都需先经低倍镜观察。
将标本片置于载物台上（正面朝上），被检部分用推进器移至物镜正下方。旋转粗动螺旋下降物镜（或升高载物台）至距离标本约0.5cm处，以左眼看目镜，同时用粗动螺旋逆时针方向慢慢升起镜筒（或降低载物台）至视野内出现物象后，改用微动螺旋上下微调至视野中出现清晰物象，并将最好部位推至视野正中央，准备换高倍镜观察。
4. 高倍镜观察 将高倍镜转至镜筒下方，操作时要从侧面注视，防止镜头与玻片相撞。调节光圈和聚光镜使光线亮度适中。观察时先用粗动螺旋慢慢升起镜筒（或降低载物台）至发现物象，再用微动螺旋上下微调至视野中出现清晰物象为止。仔细观察后，移动最好部位至视野中央，准备换油镜作进一步观察。
5. 油镜观察 在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。
6. 整理 油镜使用完毕后，用粗动螺旋慢慢升起镜筒（或降低载物台），取下载玻片，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸以直线方向擦拭镜头两次，最后再用一张干净的擦镜纸擦去二甲苯残渍。
最后将显微镜镜身各部擦拭干净，并使各部恢复至存放状态，放至镜箱中，锁好箱门。
用过的标本片，于涂面上滴一滴二甲苯，用吸水纸擦去油污至洁净后，放入标本盒中。整理、擦拭实验台，使其保持洁净。
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【结果与分析】
请手绘出你所观察的细菌形态图2~3个，并注明细菌名称及放大倍数，并对不同放大倍数的观察结果进行比较分析。
菌种名称 低倍 放大 倍
【思考题】
1. 普通光学显微镜的构造包括哪几部分？ 2. 观察细菌标本片时为什么要使用油镜？ 3. 简单油镜的使用原理是什么？ 4. 油镜使用完毕后应如何保养镜头？
5. 如何调整光源的强弱？不同强弱的光源如何影响视野中菌体标本的观
察？
6. 视野下有脏污时，应如何判断脏污所在的位置？又如何清理脏污处？ 7. 根据实验体会，谈谈如何选择不同物镜观察所需的微生物？ 【内容拓展】
1. 请拓展学习显微观察技术的发展历史和进展。 2. 请了解并掌握相差显微镜的构造、原理和使用方法。
3. 请了解电子显微镜的构造、种类、原理和使用方法。
高倍 放大 倍 油镜 放大 倍 15
实验一 (II) 细菌的涂片及简单染色法
本部分实验内容请参阅实验教程实验6（Page20-22）
【目的要求】
掌握细菌的涂片和简单染色方法。 【实验概述】
细菌的涂片和染色是微生物实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不宜辨识，必须对它进行染色，使染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能清楚地观察到其形态和构造。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合，因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的培养基中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合，当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合，又称复合染料，如伊红美蓝和伊红天青。
简单染色法即仅用一种染料使细菌着色。此法虽然操作简单，但一般只能显示其形态，不能辨识其结构。
染色前必须先固定细菌，主要原因为：一、杀死细菌并使其菌体黏附于玻片上，二、菌体对染色液的亲和力。常用的有加热和化学固定法两种。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 【实验材料】
菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 仪器：显微镜
染色液：草酸铵结晶紫或石炭酸复红。
材料：载玻片，擦镜纸，二甲苯，香柏油和玻片搁架等。 【实验方法】
1. 涂片：在洁净的玻片中央放一小滴水，用无菌的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。涂布面积约1cm2。
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2. 固定：手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，迅速来回通过酒精灯外焰3次（用手指触摸涂片反面，以不烫手为宜）。待玻片冷却后再加染色液。
3. 染色：玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）草酸铵结晶紫染色液（或石炭酸复红液）于菌膜部位，染色1~2min。
4. 水洗：倾去染色液，用洗瓶中的自来水，自玻片一端缓慢流向另一端，冲去染色液，冲洗至流下的水中无染色液的颜色为止。
5. 干燥：自然干燥或用吸水纸盖在图片部位以吸取水分（注意勿擦去菌体）。 6. 镜检：用油镜观察并绘制细菌形态图于记录本上。
7. 清理：实验完毕，清洁显微镜和涂片。有菌的玻片用洗衣粉水煮沸后清洗干净并沥干。 【结果与分析】
将细菌简单染色和形态观察的结果记录于下表中。
菌种名称 染色液名称 菌体颜色 大肠杆菌 Escherichia coli 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 菌体形态（图示）
【思考题】
1. 涂片为什么要固定，固定时应注意什么问题？
2. 你在涂片过程中遇到了什么问题？试分析其中的原因。
【内容拓展】
请自主学习革兰氏染色、芽孢染色法和荚膜染色法。 革兰氏染色步骤图示如下：
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实验二 四大类微生物菌落及细胞形态的观察
本部分实验内容请参阅实验教程实验25-28（Page72-86）
【目的要求】
1. 熟悉细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的菌落和细胞形态特征。
2. 根据四大类微生物的菌落和细胞形态特征，对一批未知菌落进行识别。
【实验概述】
微生物具有丰富的物种多样性。在光学显微镜下常见的主要有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。可识别它们的方法很多，其中最简便的方法是观察其菌落和细胞的形态特征。此法对菌种筛选、鉴定和杂菌识别等实际工作十分重要。 菌落是由某一微生物的一个或少数几个细胞（包括孢子）在固体培养基上繁殖后所形成的子细胞集团。其形态和构造是细胞形态和构造在宏观层次上的反映，两者有密切的关联性。由于上述四大类微生物的细胞形态和构造明显不同，因此所形成的菌落也各不相同，从而为识别它们提供了客观依据。
在四大类微生物的菌落中，细菌和酵母菌的形态较为接近，放线菌和霉菌的形态较为接近，现分述如下。 1．细菌和酵母菌菌落形态的异同
细菌和多数酵母菌都呈单细胞生长，菌落内的各子细胞间都充满毛细管水，从而两者产生相似的菌落，包括质地均匀，较湿润、透明、黏稠，表面较光滑，易挑起，菌落正反面和边缘与中央部位的颜色较一致等。它们的主要区别为： （1）细菌
因为细菌的细胞较小，所以形成的菌落一般也较小、较薄、较透明并较“细腻”。不同的细菌常产生不同的色素，故会形成相应颜色的菌落。更重要的是有些细菌具有某些特殊构造，于是使其也形成了特有的菌落形态特征，例如，有鞭毛的细菌常会形成大而扁平、边缘很不圆整的菌落。一般无鞭毛的细菌，只形成形态较小、突起和边缘光滑的菌落。具有荚膜的细菌可形成黏稠、光滑、透明及呈鼻涕状的大型菌落。有芽孢的细菌，常因其芽孢与菌体细胞有不同的光折射率以及细胞会呈链状排列，致使其菌落出现透明度较差，表面较粗糙，有时还有曲折的沟槽样外观等。因此，由于许多细菌在生长过程中会产生较多有机酸或蛋白质分解物，因此，菌落常散发出一股酸败或腐臭味道。
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（2）酵母菌
细胞比细菌大（直径大5~10倍），且不能运动，繁殖速度较快，一般形成较大、较厚、较透明的圆形菌落。酵母菌一般不产色素，只有少数产红色素（如红酵母属Rhodotorula），个别产黑色素。假丝酵母属（Candida）的种类因可形成藕节状的假菌丝，使菌落的边缘较快向外蔓延，因而会形成较扁平和边缘较不整齐的菌落。此外，由于酵母菌普遍生长在含糖量高的有机养料上并产生乙醇等代谢产物，故其菌落常伴有酒香味。
2．放线菌和霉菌菌落形态的异同
放线菌和霉菌的细胞都呈丝状生长，当在固体培养基上生长时，会分化出营养菌丝（基内菌丝）和气生菌丝，后者伸向空中，菌丝相互分离，它们之间无毛细管水形成，所以产生的菌落不经外观干燥、不透明，而且呈多丝状、绒毛状或毡状。由于营养菌丝伸向培养基内层，故此菌落不易被挑起。由于气生菌丝、子实体、孢子和营养菌丝有不同的构造、颜色和发育阶段，因此菌落的正反面以及边缘与中央会呈现不同的构造和颜色。 一般情况下，菌落中心具有较大的生理年龄，会较早分化出子实体和形成孢子，故颜色较深。此外，放线菌和霉菌因营养菌丝分泌的水溶性色素或气生菌丝或孢子的丰富颜色，而使培养基或菌落呈现各种相应的色泽。它们之间的区别为： （1）放线菌
放线菌为原核生物，菌丝纤细，生长较缓慢，在其基内菌丝上可形成大量气生菌丝，气生菌丝再逐渐分化出孢子丝，其上再形成色泽丰富的分生孢子。由此造成放线菌菌落具有形态较小，菌丝细而致密，表面呈粉状、色彩丰富，不易挑起以及菌落边缘的培养基出现凹陷状等特征。某些放线菌的基内菌丝因分泌水溶性色素而使培养基染上相应的颜色。不少放线菌还会产生有利于识别它们的土腥味素，从而使菌落带上有特殊土腥气味或冰片气味。
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（2）霉菌
霉菌属于真核微生物，它们的菌丝直径一般较放线菌大数倍至10倍，长度则更加突出，且生长速度极快。由于形成了与放线菌有明显区别的大而疏松或大而致密的菌落。由于其气生菌丝随生理年龄的增长会形成一定形状、构造和色泽的子实器官，所以菌落表面会形成种种肉眼可见的构造。
根霉孢囊孢子 曲霉分生孢子 青霉分生孢子
现将四大类微生物菌落的识别要点归纳如下：
菌落湿润，正反面、中央与边缘颜色一致； 小而扁平或小而隆起或大而扁平→→细菌 大而隆起→→酵母菌
菌落干燥，正反面、中央与边缘颜色不一； 小，致密→→放线菌 大，致密或疏松→→霉菌
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各种菌落形态描述如下图所示：
【实验材料】
1. 已知菌种及涂片标本
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、米根霉、黑曲霉、产黄青霉菌落标本及涂片标本。
2. 试剂材料
草酸铵结晶紫染液、20%甘油乳酸苯酚固定液、伊红美兰染液； 培养皿、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸、接种针、刀片、镊子 3. 主要仪器 显微镜 【实验方法】
1. 制备已知菌的单菌落标本
通过平板涂布或平板划线法可在相应的平板上获得细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落，用单点或三点接种法获得霉菌的单菌落。接种后，细菌平板可放置在37℃恒温箱中24~48h，酵母菌为28℃下2~3天，霉菌和放线菌置于25~28℃培养5~7天。
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2. 观察已知菌的玻片标本
用显微镜观察细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）、放线菌（灰色链霉菌）、酵母菌（酿酒酵母）及霉菌（米根霉、黑曲霉、产黄青霉）的细胞、菌丝或孢子形态特征。
3. 制备未知菌落的单菌落和玻片标本
参照步骤1，通过平板涂布、平板划线或单点法获得未知菌的单菌落，进行菌落特征观察辨识。
根据菌落形态特征参照步骤2制备玻片进行显微观察。 4. 辨识未知菌落
按上述表解进行辨认，并将结果填入下面相应的表格中。 【结果与分析】
1. 将观察到的已知菌落形态特征记录在下表中 （1）菌落特征
辨识要点 四大类型 菌种名称 干 厚薄 大肠埃希氏菌 细菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 酿酒酵母 酵母菌 粘红酵母 灰色链霉菌 放线菌 产黄青霉 霉菌 黑曲霉 大小 湿 表面 松密 大小 边缘 隆起形状 正面 反面 水溶色素 菌落描述 颜色 透明度
（2）细胞形态
显微特征描述 四大类型 菌种名称 细菌、酵母细胞形态描述 放线菌、霉菌菌丝、孢子丝、孢子形态 细菌 大肠埃希氏菌 23
金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 酿酒酵母 酵母菌 粘红酵母 灰色链霉菌 放线菌 产黄青霉 霉菌 黑曲霉
2. 将观察到的未知菌落识别结果记录在下表中
菌 落 厚薄 号 1 2 3 4 5 大小 松密 大小 表面 边缘 隆起形状 正面 反面 水溶色素 湿 干 菌落描述 颜色 透明度 描述 显微 特征 判断结果 【思考题】
1. 菌落干燥与湿润的原因是什么？为什么这一标准在四大类微生物识别中占有重要地位？
2. 试分析影响菌落大小的内外因素是什么？
3. 具有鞭毛、荚膜和芽孢的细菌在它们形成菌落时，一般会出现哪些相应特征？
4. 如何从菌落形态和孢子形态区别辨识霉菌和放线菌？ 【内容拓展】
请结合所学知识，自主学习如何观察和辨识微藻、蕈菌？
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综合大实验(三~十) 产酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化
生物技术专业学生分离产淀粉酶菌种 制药工程专业学生分离产蛋白酶菌种
本部分实验内容可参阅实验教程实验42（Page126-128）及其他参考书
【目的要求】
以某一产酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化实验为例，系统学习并掌握微生物学的基本研究方法，达到以下目的：
1. 掌握采用平板涂布法、划线法纯化特定微生物菌种的基本方法； 2. 学习掌握基础培养基和选择性培养基的设计、配制、分装和灭菌方法； 3. 学习微生物菌种的常用保藏技术；
4. 学习掌握采用染色法和生理生化反应初步鉴定微生物菌种的方法； 5. 认识并学习紫外线诱变对特定产酶菌种生长及产酶性能的影响； 6. 学习特定产酶微生物的液体培养和发酵条件优化方法。 【实验概述】
自然界中蕴藏着种类繁多的微生物资源。土壤是微生物生存的大本营，是微生物最为重要的资源库。从自然界中筛选具有特定功能的优良菌种是微生物工作者的一项重要任务，也是一件极其细致和艰辛的工作。获得具有优良性状及潜在产业化生产能力的功能微生物通常需要达到“亿万挑一”的地步。
菌种分离筛选的一般步骤为“采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定→良种保藏与鉴定”。
本实验结合《微生物学》、《微生物工程》和《酶工程》课程中的基础理论和技术，以某一产酶（淀粉酶或蛋白酶）微生物的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化综合实验为例，系统学习并掌握微生物与微生物工程，以及微生物发酵产酶的基本研究方法。
本实验选择的淀粉酶和蛋白酶是研究和应用最为广泛的两种酶，工业上主要采用微生物发酵法生产，广泛应用于食品加工、轻化工、纺织与皮革工业、生物医药等领域，作为本科生实验内容具有典型性和代表性。 【材料与方法】 1．实验材料
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（1）实验材料
含菌土样
葡萄糖、蔗糖、琼脂、淀粉、酪蛋白、酪氨酸、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、KCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、KNO3、95%乙醇、NaOH、HCl、NaCO3、三氯乙酸等；
染色剂：草酸铵结晶紫、碘液、番红、20%甘油乳酸苯酚试剂等。 无菌水、培养皿、玻璃棒、试管、移液管、洗耳球、三角烧瓶、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种针、pH试纸、灭菌牙签等。 （2）仪器设备
电子天平、显微镜、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、离心机、冰箱等。 2．实验方法
详细、具体的实验方法必须在提交的实验报告中介绍清楚！
（1）含菌样品的采集
根据所选产酶菌种的要求，确定采集样地。例如，分离产纤维素酶菌的土样宜在林地采集，产淀粉酶的菌种宜在淀粉制品霉变的样品中分离，产蛋白酶的菌种宜在豆制品样品中分离。
本部分内容可参阅实验教程实验42及《微生物工程》和《酶工程》教材！
（2）培养基的设计、配制、分装和灭菌
配制供细菌、酵母菌、放线菌和霉菌生长用的通用培养基的程序大致相同，即先按配方称取药品，用少于总量的水分先溶解各组分，待完全溶解后补足水至所需的量，再调整pH，然后将培养基分装于合适的容器中，经灭菌后收藏、备用。有些实验要求将配制的培养基放置在合适温度培养过夜，待确证无杂菌后才可使用。
配制一般的固体培养基时所用的凝固剂可直接用市售的琼脂粉或琼脂条，配制液体培养基时则不加凝固剂。
配制好的培养基应根据成分的耐热程度选用不同的灭菌方法，最常用的是加压蒸汽灭菌法。配制后的培养基如果来不及灭菌时应暂存在冰箱冷藏，以防止因杂菌的生长而破坏其中的营养成分。
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在本实验中，应根据产酶菌种的要求，须要配制用于菌种分离纯化的固体培养基和用于液态发酵的液体培养基。固体培养基包括选择性培养基、斜面保藏培养基，液体培养基包括种子培养基和产酶发酵培养基等。同学们应根据实验的实际情况，参阅文献配制不同类型和用途的培养基，并计算好用量和所用玻璃器皿。
本部分内容可参阅实验教程实验11、12（Page30-37）！
（3）产酶菌种的纯种分离
在自然状态下，各种微生物一般都是杂居混生在一起的。为从混杂的试样中获得所需的微生物纯种，或是在实验室中把受污染的菌种重新纯化，都离不开菌种分离纯化的方法。所以掌握纯种分离技术是每一个微生物学工作者的基本功之一。最常用的是微生物纯种分离方法是涂布平板法和平板划线法。
涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌涂布玻璃棒把菌液均匀地涂布在整个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取经典的代表移接至斜面，经培养后保存。
平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上做多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相对独立的多个单菌落。
在分离某一新菌种时，为保证所获纯种的可靠性，一般可用上述方法反复分离多次来实现。
在本实验中，要求同学通过对所采集样品进行梯度稀释后，用涂布平板法和平板划线法在选择性固体培养基上进行纯种分离，获得产酶菌种。
本部分内容可参阅实验教程实验16、17（Page46-52）！
（4）产酶菌种的斜面保藏
在生产实践和科学研究中所获得的优良菌种是重要的微生物资源。为了能较长期地保持原种的特性，防止菌种的衰退和死亡，人们创造了许多菌种保藏的方法，建立了系统的管理制度。
菌种的各种变异都是在微生物生长繁殖的过程中发生的，因此为了防止菌种
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的衰退，在保藏菌种时首先要选用它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等，并要创造一个低温、干燥、缺氧、避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能较长期地维持其休眠状态。
常用的菌种保藏方法有：斜面或半固体穿刺菌种的冰箱保藏法，石蜡油封藏法，沙土保藏法，冷冻干燥保藏法和液氮保藏法等。
本实验要求同学们掌握最常用的斜面菌种保藏技术和甘油保藏法。 本部分内容可参阅实验教程实验33、34（Page94-97）！
（5）菌种染色观察
细菌的涂片和染色是微生物实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不宜辨识，必须对它进行染色，使染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能清楚地观察到其形态和构造。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合，因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的培养基中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合，当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合，又称复合染料，如伊红美蓝和伊红天青。
本实验要求同学们采用简单染色或复染色（革兰氏染色）方法，对所筛选菌种的细胞形态和结构进行观察。可参考的细菌的染色方法有简单染色、革兰氏染色、芽孢染色法、荚膜染色法等。
本部分内容可参阅实验教程实验6、7、8（Page20-25）！
（6）菌种的常规生理生化鉴定
细菌的个体微小，形态简单，常需借助于它们在生理生化上的不同反应作为分类鉴定的主要依据。由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽然利用相同的底物但产生的代谢产物却不相同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的菌种。常规生理生化鉴定试验有糖发酵实验（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖）、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、甲基红试验（MR试验）、
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吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、接触酶（过氧化氢酶）试验、硫化氢产生试验等。
本实验要求，筛选所得菌种为细菌的小组对菌种进行糖发酵实验、MR试验、接触酶试验和硫化氢产生试验。
本部分内容可参阅实验教程实验37（Page103-106）及其他实验教程！
（7）紫外线对特定产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应
紫外线是一种最常用的物理诱变剂，它用于微生物菌种的诱变处理有着悠久的历史。据统计，目前生产上经诱变处理后得到的抗生素高产菌种中，大约80%是经过紫外线处理后获得的。
紫外线波长在200~380nm之间，但对诱变最有效的波长是在253~265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约占80%是254nm。紫外线诱变主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，并阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起基因突变，最终导致微生物表型变化（如引起酶活力或抗药性的变化）或死亡。
紫外线照射后造成的DNA损伤，通常可在可见光照射下，由光解酶的作用使胸腺嘧啶二聚体解开，而得以恢复正常。因此，当用紫外线进行微生物诱变处理及处理后的操作时，应在红光下进行操作，同时需将处理后的微生物置于暗处培养。
本部分内容可参阅实验教程实验44（Page131-133）及其他实验教程！
（8）碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能的影响
碳源和氮源是微生物生长及积累代谢产物必需的重要营养物质。不同的微生物菌种对不同碳源和氮源的利用程度不同。而且从酶的微生物合成角度考虑，碳源和氮源既能为微生物的生长提供必需的营养和能量，同时也是酶生物合成的诱导性底物。例如，淀粉是淀粉酶合成的良好诱导底物，纤维素类底物是合成纤维素酶的诱导底物，有机氮源是合成蛋白酶的诱导底物。
本实验要求根据所筛选产酶菌种的特性，选择碳源或氮源进行其种类和最佳浓度的优化。建议筛选蛋白酶产生菌种的优化氮源种类及浓度，筛选淀粉酶或纤维素酶产生菌种的优化碳源种类及浓度。
本部分内容可参阅实验教程实验40（Page122-123）及其他实验教程！
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（9）pH值对产酶菌种生长及产酶性能的影响
微生物的生长及代谢产物的合成受到所处环境的影响极大。对微生物生长有重要影响的环境因素主要包括温度、pH值和氧气等。
本实验主要考察培养基的pH值对产酶菌种生长及产酶性能的影响。pH值的影响主要表现在：一是影响细胞膜所带的电荷，从而影响细胞对营养物质的吸收；二是改变培养基中有机化合物的离子化作用程度。任何微生物都有三种基本生长pH值，与温度类似，即最低、最适和最高pH值或温度。微生物生长的pH值范围一般为4.0~9.0，少数微生物可在极端pH值下生存。一般适合细菌生长的pH值接近中性，pH较低（<4.0）时不易生长，放线菌适合在微碱性条件下生长，酵母和霉菌适合在偏酸性条件（pH 4.0~6.0）下生长。
同学可根据产酶菌种的类型和培养基成分，设计pH值梯度范围进行考察。 本部分内容可参阅实验教程实验41（Page124-125）及其他实验教程！
【实验设计总体技术路线】
采集含菌样品→设计配制选择性培养基→分装灭菌→平板涂布分离纯化菌种（透明圈法）→划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法）→液体培养法复筛产酶菌种，检测产酶性能→目的菌种斜面和甘油保藏→目的菌种的染色法显微观察→目的菌种的常规生理生化鉴定→考察紫外线对产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应→考察碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能的影响→考pH值对产酶菌种生长及产酶性能的影响
【结果与分析】
请参照“实验设计方案与实验报告撰写要求”部分记录实验结果，并做分析和讨论。
结果与分析部分要求图、表、文并茂，必须提供的实验结果材料如下： 1. 平板涂布法或划线法分离菌种的平板照片1张；
2. 选择性培养基上单点法或三点法接种培养的产酶菌种菌落照片1张； 3. 斜面保藏和甘油保藏试管照片各1张； 4. 菌种的显微染色照片1张；
5. 生理生化鉴定结果照片、表各1张；
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6. 紫外线对产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应的图、表各1张，包括诱变后平板菌落照片，不同剂量紫外线对菌落数、菌落形态的影响及诱变效应曲线；
7. 碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能影响的图或表，包括对菌体生长浓度和酶活力影响的曲线或柱状图；
8. pH值对产酶菌种生长及产酶性能影响的图或表，包括对菌体生长浓度和酶活力影响的曲线或柱状图；
9. 实验中发现的其他重要结果。
【思考题】
针对小组实验结果，进行分析和讨论，并总结实验中存在的问题和结论。
【内容拓展】
参考本实验内容，请拓展学习以下内容：
1. 设计利用16S rRNA基因序列分析技术鉴定你所筛选获得的产酶菌种。可参阅实验教程实验39（Page112-120）。
2. 设计采用单因素试验和正交试验设计法优化产酶培养基成分的实验，主要从碳源、氮源和无机盐的种类及浓度方面考虑。
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附录
附录1 微生物实验常用菌种及其学名
细菌
菌种中文名称 蜡状芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 拉丁学名 Bacillus cereus Bacillus subtilis Bacillus licheniformis 菌种中文名称 黄色短杆菌 大肠埃希菌 拉丁学名 Brevibacterium flavum Escherichia coli 保加利亚乳杆菌 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus delbrueckii Acetobacter Pseudomonas aeruginosa 嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilus 德氏乳酸杆菌 苏云金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis 巨大芽孢杆菌 破伤风梭菌 肉毒梭状杆菌 Bacillus megaterium Clostridium tetani Clostridium botulinum 醋酸杆菌属 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium
放线菌
菌种中文名称 链霉菌属 灰色链霉菌 吸水链霉菌 拉丁学名 Streptomyces Streptomyces griseus Streptomyces hygroscopicus 菌种中文名称 孢囊链霉菌属 游动放线菌属 小单孢菌属 拉丁学名 Streptosporangium Actinoplanes Micromonospora
真菌
菌种中文名称 黑曲霉 黄曲霉 米曲霉 青霉属 产黄青霉 毛霉属 米根霉 木霉属 拉丁学名 Aspergillus nige Aspergillus flavus Aspergillus oryzae Penicillium Penicillium chrysogenum Mucor Rhizopus oryzae Trichoderma 菌种中文名称 里氏木霉 白色念珠菌 产朊假丝酵母 酿酒酵母 粗糙脉孢菌 巴氏毕赤酵母 红酵母属 白地霉 拉丁学名 Trichoderma reesei Monilia albican Candida utilis Saccharomyces cerevisiae Neurospora crassa Pichia pastoris Rhodotorula Geotrichum candidum
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附录2 常用培养基成分及其配制
一、细菌常用培养基
1、 营养肉汤（多数细菌培养之用）
牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，蒸馏水100 mL，pH7.2~7.4，121°C灭菌15min。 2、 营养肉汤琼脂
牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，琼脂1.5~2.0 g，pH7.2~7.4，121°C灭菌15min。
注：用于倾注平板法菌落计数，琼脂量为1.5%；用于涂布平板法菌落计数或制成斜面，琼脂量为2%；制成半固体培养基，琼脂量为0.7%~0.8%。 3、 LB（Luria-Bertani）培养基
胰蛋白胨1 g，氯化钠1 g，酵母提取物0.5 g，蒸馏水100 mL，pH7.0，121°C灭菌20min。
注：含氨苄青霉素LB培养基，待LB培养基灭菌后冷至50°C左右加入抗生素，至终浓度为80~100 mg/l。 4、钾细菌培养基（培养钾细菌产荚膜）
蔗糖5 g，磷酸氢二钠0.02 g，硫酸镁0.2 g，三氯化铁微量，蒸馏水100 mL，pH 7.0~7.2，115°C灭菌15min。 5、 明胶培养基
牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，明胶12 g，pH7.2~7.4，112°C灭菌20min。 6、 乙酸菌培养基
豆芽汁（10%~20%）100 mL，葡萄糖5 g，碳酸钙2 g，pH自然，115°C灭菌20min。
豆芽汁制备：称取10~20 g豆芽，加100mL水，煮沸半小时后用纱布过滤，水补足原量，再加入蔗糖5 g，自然pH。 7、 丙酸菌培养基
乳酸钙2 g，蛋白胨2 g，磷酸氢二钾0.2 g，氯化钠0.2 g，蒸馏水100 mL，pH 6.9~7.2，121°C灭菌15min。
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8、 乳酸菌培养基
麦芽汁2.5 g，蛋白胨0.5 g，牛肉膏0.4 g，氯化钠0.3 g，碳酸钙适量，蒸馏水100 mL，121°C灭菌15min。 9、 双歧杆菌增殖培养基
葡萄糖2%，酵母浸出膏1%，胰蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，大豆蛋白胨0.5%，低聚果糖0.5%，牛肝浸液5%，K2HPO40.2%，NaCL0.3%，L-半胱氨酸盐酸盐0.1%，pH7.5，121°C灭菌15min。 10、己酸菌培养菌
磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.01 g，硫酸铵0.03 g，硫酸亚铁0.02 g，酵母膏0.5 g，碳酸钙5 g，蒸馏水100 mL，121°C灭菌15min。
注：灭菌后再加入5%碳酸钠2%，5%硫酸钠1%，乙醇1%。
二、霉菌与酵母菌常用培养基
1、 MY培养基（酵母菌保藏用）
麦芽汁0.3 mL，葡萄糖1 g，酵母膏0.3 g，蛋白胨0.5 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，115°C灭菌20min。 2、 PYG培养基（酵母菌保藏用）
蛋白胨0.35 g，酵母膏0.3 g，葡萄糖1 g，硫酸铵0.1 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸镁0.1 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，115°C灭菌20min。 3、 YPD培养基
葡萄糖2 g，胰蛋白胨2 g，酵母膏1 g，蒸馏水100 mL，pH5.0~5.5，115°C灭菌20min。
4、 查氏（Czapack）培养基
硝酸钠0.3 g，氯化钾0.05 g，磷酸氢二钾0.1 g，硫酸铁0.001 g，硫酸镁0.5 g，蔗糖3 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，pH自然，115°C灭菌20min。 5、 麸皮培养基
麸皮3.5 g，琼脂2 g，自来水100 mL，pH自然，121°C灭菌15min。 制法：煮沸0.5 h，用棉花或者纱布过滤，去残渣，滤液补足水分。 6、 马丁氏（Martin）培养基
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葡萄糖1 g，蛋白胨0.5 g，磷酸二氢钾0.1 g，硫酸镁0.05 g，孟加拉红溶液(1 mg/mL)0.33 mL，去氧胆酸钠溶液2 mL（单独灭菌，临用前加入），链霉素溶液(10 000U/mL)0.33 mL（单独灭菌，临用前加入），蒸馏水100 mL，pH自然，112°C灭菌30min。
7、 马铃薯汁琼脂培养基（PDA）
马铃薯（去皮）20 g，葡萄糖1 g，水100 mL，琼脂2 g，pH自然，121°C灭菌15min.。
制法：取新鲜马铃薯，去皮，挖掉芽眼，洗净，切片。称取20 g，切成小块，加入100 mL水煮沸30min，用双层纱布过滤，滤液补足水分。 8、麦芽汁琼脂培养基
麦芽汁制备方法：取大麦芽一定数量，粉碎，1份麦芽加4份水，在60~65°C保温糖化，不断搅拌，3~4h直到液体中无淀粉反应为止（检查方法：取糖化液0.5mL，加碘液2滴，如无蓝色出现，即糖化完），用4~6层纱布过滤，滤液如浑浊不清，可用蛋清加水（一个蛋清加水约20 mL），调匀至泡沫为止，然后倒入糖化液中搅拌，煮沸后再用滤纸或脱脂棉过滤，即得澄清的麦芽汁，再加入稀释成8~10°Be麦芽汁。
三、放线菌常用培养基
1、 PSA（放线菌菌种保藏）
酵母膏0.2 g，可溶性淀粉1 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，pH7.2，121°C灭菌15min。 2、 高氏Ⅰ号培养基（适用于多数放线菌保藏，孢子生长良好）
可溶性淀粉2 g，硝酸钾0.1 g，氯化钠0.05 g，磷酸氢二钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，硫酸铁0.001 g，蒸馏水100 mL，pH7.2~7.4，121°C灭菌15min。 3、 高氏Ⅱ号培养基（菌丝生长良好）
蛋白胨0.5 g，葡萄糖1 g，氯化钠0.5 g，蒸馏水100 mL，pH7.2~7.4，121°C灭菌15min。
4、 马铃薯蔗糖培养基
20%马铃薯浸汁100 mL，蔗糖2 g，琼脂2 g，pH6.0，121°C灭菌15min。
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附录3 常用染色液和试剂的配制
一、染色液
1、 吕氏美蓝染色液
A液：美蓝（次甲基蓝、亚甲基蓝、甲烯蓝）0.6 g，95%乙醇30 mL B液：0.01%氢氧化钾溶液100 mL
将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。 2、 草酸铵结晶紫液
A液：结晶紫2 g，95%乙醇20 mL B液：草酸铵0.8 g，蒸馏水80 mL 将B液加入A液即成。
3、 石碳酸乳酸溶液（观察霉菌形态用）
石碳酸10 g，乳酸（相对密度1.21）10 mL，甘油20 mL，蒸馏水10 mL 将石碳酸倒入水中加热分解，然后慢慢加入乳酸和甘油。 4、 革兰氏染色液
（1） 草酸铵结晶紫溶液（革兰氏A液） A液：结晶紫2 g ，95%乙醇20 mL B液：草酸铵0.8 g，蒸馏水80 mL 将B液加入A液即成。
（2） 卢哥氏碘液（革兰氏B液） 碘片1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 mL
先将碘化钾溶解于少量水中，再加入碘，待完全溶解后，加足水分即成。 （3）95%乙醇（脱色剂）
（4）蕃红（沙黄）染液（复染剂）： 蕃红2.5 g，95%乙醇10 mL，蒸馏水100 mL 将蕃红溶解于95%乙醇中，再加蒸馏水，混合过滤。 5、 芽孢染色液 （1） 孔雀绿染液： 孔雀绿5 g，蒸馏水100 mL （2） 蕃红染液： 蕃红0.5 g,，蒸馏水100 mL
（3） 碱性复红染色液（芽孢及伴孢晶体观察） 碱性复红染料0.5 g，95%乙醇20 mL，蒸馏水
将染料溶于乙醇中，然后加蒸馏水稀释至100 mL。如有不溶物时，可以用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。
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6、 荚膜染色液 （1） 负染色法：
6%葡萄糖水溶液，绘图墨水，无水乙醇，蕃红染液 （2） 奥尔特氏荚膜染色液： 蕃红3 g，蒸馏水100 mL 用乳钵研磨溶解。 7、 鞭毛染色液 （1） 银染法：
A液：单宁酸5 g，氯化铁1.5 g，蒸馏水100 mL，15%福尔马林2 mL，1%氢氧化钠1 mL
B液：硝酸银2 g，蒸馏水100 mL
A液配好后，当天使用，次日效果差，第三天就不好使用。
B液配制时，待硝酸银溶解后，取出10 mL备用，向其余的90 mL硝酸银中滴加浓NH4OH，使之成为很浓的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10 mL硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴加硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。
如所呈雾不重，此染剂可使用一周；如雾重，则说明银盐沉淀出，不宜使用。通常在配制当天使用，冰箱内保藏一星期可以使用。 （2） 利夫森氏（leifson）鞭毛染色液。 A液：氯化钠1.5 g，蒸馏水100 mL B液：单宁酸3 g，蒸馏水100 mL C液：碱性复红1.2 g，95%乙醇100 mL 临用前将A、B、C三种染色液取等量混合。 8、 酵母子囊孢子染液 （1） 石碳酸蕃红染液：
蕃红0.1 g，95%乙醇10 mL，30%石碳酸溶液90 mL 将蕃红溶解于乙醇中，然后加入30%石碳酸溶液 （2）3%盐酸—乙醇： 浓盐酸3 mL，95%乙醇97 mL （3）1%次甲基蓝染液： 9、细胞壁染色液 （1）单宁酸法： A液：5%单宁酸水溶液 单宁酸5 g，蒸馏水100 mL
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B液：0.2%结晶紫水溶液 结晶紫0.2 g，蒸馏水100 mL （2） 磷钼酸法： A液：1%磷钼酸水溶液 磷钼酸1 g，蒸馏水100 mL B液：1%甲基绿水溶液 甲基绿1 g，蒸馏水100 mL
10、乳酸石碳酸棉蓝染液（观察真菌形态用）
石碳酸10 g，乳酸（相对密度为1.21）10 mL，甘油（相对密度为1.25）20 mL，蒸馏水10 mL，棉蓝0.02 g
配制时先将石碳酸放入水中加热溶解，然后，慢慢加入乳酸及甘油，最后加入棉蓝即成。 11、
脂肪粒染液
苏丹黑—B液（Sudan black B）：
苏丹黑0.5 g，70%酒精100 mL，二甲苯，0.5%蕃红水溶液
二、常用试剂
1、 碘液（淀粉水解实验）
碘片1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 mL 2、 0.85%生理盐水
氯化钠0.85 g，蒸馏水100 mL 3、 斐林试剂甲液（还原糖测定试剂）
精确称取五水硫酸铜5 g，次甲基蓝0.05 g，用蒸馏水溶解后，于500 mL容量瓶中加蒸馏水定容。
4、 斐林试剂乙液（还原糖测定试剂）
精确称取氢氧化钠54 g，酒石酸钾钠50 g，亚铁氰化钾4 g，用蒸馏水溶解后，于500 mL容量瓶中加蒸馏水定容。 5、 0.1%标准葡萄糖液
精确称取预先在105°C干燥至恒重的无水葡萄糖（AR）（1.00±0.002）g，用蒸馏水溶解后，于1000 mL容量瓶中加蒸馏水定容。
三、抗生素溶液
1、链霉素溶液（10000U/mL）
标准链霉素制品为10 000 000U/瓶，先准备好100mL无菌水，在无菌条件
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下用无菌移液管吸取0.5mL无菌水加入链霉素标准制品瓶中，待链霉素溶解后取出加至另一无菌锥形瓶中，如上操作反复用无菌水洗链霉素标准瓶5次，最后，将所剩余无菌水全部转移至链霉素溶液中为止，此链霉素溶液为10 000U/mL。 2、氨苄青霉素溶液（8 mg/mL和25 mg/mL）
称取氨苄基青霉素（医用粉剂）8 mg和25 mg，分别溶于1 mL无菌蒸馏水中，临用时配制。或临用时再经滤膜器过滤除菌。
四、指示剂
1、0.04%甲基红
甲基红0.04 g，95%乙醇60 mL，蒸馏水40 mL 2、0.04%溴甲酚紫水溶液
溴甲酚紫0.04 g，蒸馏水，100 mL 3、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
溴甲酚紫1.6 g，95%乙醇50 mL，蒸馏水50 mL (储存于棕色瓶中备用) 4、1%石蕊
石蕊1 g，蒸馏水100 mL 5、2%伊红Y液
伊红Y2 g，蒸馏水100 mL 6、5%碱性品红乙醇溶液 碱性品红5 g，95%乙醇100 mL 7、0.65%美蓝溶液
美蓝（次甲基蓝、亚甲基蓝、甲烯蓝）0.65 g，蒸馏水100 mL 8、0.1%孟加拉红溶液
孟加拉红100 mg，蒸馏水100 mL 9、0.2%溴麝香草酚蓝溶液
羞射香草酚蓝0.2 g，0.1mol/l氢氧化钠5 mL，蒸馏水95 mL
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附录4 常用缓冲液配制表
在加入一定量的酸或碱时，溶液的氢离子浓度改变甚微或者几乎不变，此种溶液称为缓冲溶液。溶液内所含物质称为缓冲剂，缓冲剂组成多为弱酸及这种强碱所组成的盐，或弱碱及这种弱碱与强酸所组成的盐，调节两者比例可配成各种pH的缓冲液。
1、0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.0、pH7.0）
K2HPO4相对分子质量为174.18，0.1mol/L溶液为17.4 g/L，称取17.4 g K2HPO4溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
KH2PO4相对分子质量为136.09，0.1mol/L溶液为13.6 g/L，称取13.6 g KH2PO4溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
0.1mol/L磷酸缓冲液
pH 0.1mol/L K2HPO4/mL 0.1mol/L KH2PO4/mL
6.0 13.2 86.8 7.0 61.5 38.5
2、0.2mol/L磷酸缓冲液（pH5.8、pH6.0、pH7.4）
Na2HPO4·2H2O相对分子质量为178.05，0.2mol/L溶液含35.61 g/L，称取35.61g Na2HPO4·2H2O，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
NaH2PO4·H2O相对分子质量为138.01，0.2mol/L溶液含27.6 g/L，称取27.6 g NaH2PO4·H2O，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
0.2mol/L磷酸缓冲液
pH 0.2mol/L Na2HPO4/mL 0.2mol/L NaH2PO4/mL
5.8 8.0 92.0 6.0 12.3 87.7 7.4 81.0 19.0
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附录5 常用消毒剂表
名称 升汞 甲醛（市售含量 挥发慢，刺激性强 为37%~40%） 乙醇 苯酚 新洁尔灭 稳定，对芽孢无效 醋酸 高锰酸钾溶液 硫磺 生石灰 来苏尔 漂白粉 棉制品，刺激皮肤，易潮解 有效氯(次氯酸钠)含量为1.1%~ 1.3%，可杀灭肠道致病菌、化脓性84消毒液 球菌和细菌芽孢，有刺激性气味，具腐蚀性 有效氯含量：500mg/L 1份消毒剂+24份水混合 表面擦拭、喷洒或浸泡 浓烈酸味 强氧化剂，稳定 粉末，通过燃烧产生SO2， 杀菌，腐蚀金属 杀菌力强，腐蚀性大 杀菌力强，有特殊气味 有效氯易挥发，腐蚀金属及 3%~5% 喷洒接种室和培养室 1%~3% 3%~5% 消毒地面及排泄物 接种室、表面消毒 5~10mL/m3加等量水蒸发 0.1% 15g硫磺/m3熏蒸 接种室消毒 皮肤及器皿消毒 空气消毒 消毒力不强，对芽孢无效 杀菌力强，有特殊气味 易溶于水，刺激性小， 0.25% 皮肤及器皿消毒 70%~75% 3%~5% 皮肤消毒 接种室、器皿消毒 主要性质 杀菌力强，腐蚀金属器械 浓度及使用方法 0.05%~0.1% 10mL/m2加热熏蒸 用途 植物组织和虫体外消毒 接种室消毒
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参考文献
【1】 袁丽红 主编. 微生物学实验[M]. 北京：化学工业出版社，2010.2.
（推荐参考教材）
【2】 周德庆 主编. 微生物学实验教程[M]. 北京：高等教育出版社，2006.3. 【3】 杨革 主编. 微生物学实验教程[M]. 北京：科学出版社，2010.1.
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